凯氏定氮法测定速冻调制食品蛋白质过程探讨

吴同辉

淮北市产品质量监督检验所 安徽淮北 235000

随着社会进步和生活节奏的加快，人们用于备餐、用餐的时间越来越少，由此产生了对食品便利性的需求。同时随着家庭冰箱的普及与应用，极大地推动了人们日常饮食方式朝着多元化的方向发展，这为速冻调制食品的广泛普及与推广提供了有利条件。

速冻调制食品是指以农产品、畜禽肉、水产品、植物蛋白制品、果蔬类制品等为主要原料，经调味加工处理后，运用速冻工艺，在低温状态下贮存、运输、销售的预包装食品[1]。

速冻调制食品由于其食用方便、储存时间长、不易变质等特点，逐渐成为人们餐桌上不可或缺的食品。

1 速冻调制食品蛋白质测定的重要性

蛋白质是人类生命的物质基础，是一切生命活动的主要承担者。人体内蛋白质的种类有很多，功能也多种多样，其含量大都在16%～20%之间，人体内几乎所有重要的组成部分都与蛋白质有关联。在日常生活中，人类尤其是儿童一旦缺乏蛋白质的摄入，会直接引起人体营养不良、代谢功能紊乱、抵抗力下降等情况，严重的会损伤人体器官，甚至会危及生命安全。

由于市场上销售的速冻调制食品的种类有很多，所以人们在选择购买时要进行综合考虑，既要考虑食品的价格，又要关注食品本身的营养价值。蛋白质作为食品营养价值中的一项重要指标，其含量常常作为人们选择速冻调制食品的依据之一。

根据标准《SB/T 10379-2012速冻调制食品》，其中并未规定蛋白质的测定方法，所以如何选择蛋白质测定方法至关重要。

实验室中常用的蛋白质测定方法有凯氏定氮法、分光光度法、燃烧法以及近红外法等，其中最常用的方法是凯氏定氮法。标准《GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中提到，凯氏定氮法测定蛋白质含量过程主要有样品处理、消化、蒸馏、滴定四个步骤，下面就谈谈国标凯氏定氮法测定速冻调制食品蛋白质含量需要注意的这几个方面。

2 国标凯氏定氮法测定速冻调制食品蛋白质含量的过程

2.1 样品处理

检验人员在进行速冻调制食品处理时，所选择的样品应具有代表性。体积较大的固体样品应用剪刀或粉碎设备制备成细小均匀的状态，带骨的样品应剔骨取可食用部分。由于速冻调制食品长时间低温冷冻储藏，样品处理时间过长容易造成样品表面积水，从而影响样品蛋白质测定结果的准确性。因此整个过程尽可能缩短取样时间，快速取样。

样品称量时，为保证最终滴定时所消耗的酸标准滴定溶液处于有效范围内，称样量应视样品含氮量而定。含氮量较高的样品，应减少称样量，反之亦然。

速冻调制食品由于水分较大，称量时易黏着于称量纸表面，因此样品称好后应与称量纸一起置于定氮瓶底部，同时取相同规格的称量纸作空白对照。将称量好的样品放入定氮瓶中时，切勿让样品黏着在定氮瓶的颈部，若出现黏着可用少量纯水冲下，以免黏着在颈部的样品无硫酸消化，而造成样品中氮的损失。

2.2 消化

对于速冻调制食品而言，其糖、脂肪含量大多较高，消化过程中要注意浓硫酸的用量、催化剂的使用以及电炉的控制，以保证样品消化完全、彻底、无损失。

2.2.1 浓硫酸的用量

当样品中的糖、脂肪含量较高，或称样量增加时，浓硫酸的用量也应随之增加。样品中糖、脂肪含量过高，会使分解样品所用浓硫酸的量增加，导致初始浓硫酸的量不足以正常生成硫酸铵而造成氮的损失。同时，硫酸减少，过多的硫酸钾会提高定氮瓶中反应溶液的温度，也会引起氮的损失。

因此，当硫酸被过多消耗，或样品中糖、脂肪含量较高时，要适当增加浓硫酸的用量。

2.2.2 催化剂的使用

样品消化时，加入的硫酸铜是消化反应过程中的催化剂，也是消化液蒸馏过程碱性反应的指示剂。硫酸钾是为了提高消化反应溶液的温度，缩短样品消化的时间。

2.2.3 电炉的控制

通过调节电炉旋钮，控制消化反应的温度和时间。开始消化时，检验人员应将定氮瓶以45°角斜支于石棉网上，小火加热，使火力集中在定氮瓶底部，待内容物全部碳化且泡沫完全停止后，逐步升温至380～420℃，并保持瓶内液体微沸。整个消化过程要避免使用强火，以免消化液飞溅至定氮瓶瓶壁上甚至溢出瓶外。同时检验人员要时常转动定氮瓶，便于冷凝酸液将黏着在瓶壁上的样品洗下并促进其消化完全[2]。

检验人员要合理控制消化时间，待消化液呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1h即可。消化过程中要避免消化时间过长造成硫酸被大量消耗，使已生成的硫酸铵发生分解而释放出氨，同时也要防止消化时间过短而引起消化反应不完全的情况。

对于糖、脂肪含量较高的样品，由于消化时易产生大量泡沫，检验人员在加入硫酸铜、硫酸钾、硫酸后，再加入少量辛醇、几滴过氧化氢、硅油或液体石蜡，可消除泡沫。对于消化结束后不易得到澄清消化液的样品，可将定氮瓶从电炉上取下放冷后，缓慢加入2～3mL 30%过氧化氢加快其消化[3]。

2.3 蒸馏

蒸馏前，检验人员要仔细检查凯氏定氮蒸馏装置的气密性。向水蒸气发生器中依次加入2/3的纯水、少量硫酸、几滴甲基红-乙醇溶液，同时加入几粒玻璃珠以防止纯水暴沸。蒸馏时，小玻杯要用棒状玻塞塞紧并水封，以防止定氮蒸馏装置漏气造成氨的逸出。

2.3.1 氢氧化钠溶液

蒸馏时，检验人员要合理控制40%氢氧化钠溶液的加入量。过少会使反应溶液呈蓝色而蒸馏不完全，过多会造成试剂的浪费。

40%氢氧化钠溶液的用量是根据样品消化时浓硫酸的消耗量而定的，在保证完全中和消化液中剩余浓硫酸的基础上，继续加入40%氢氧化钠溶液，使定氮瓶内的氢氧化钠溶液的浓度维持在0.9～1.0mol/L，以确保样品消化液中的(NH4)2SO4全部转化为NH4OH[4]。

2.3.2 硼酸吸收液

根据国家标准规定，2%硼酸吸收液的体积用量为10mL。实际上由于硼酸酸性较弱，蛋白质测定实验对硼酸体积的要求并不严格，检验人员可以直接用量筒量取，这样既可免去移液管的使用，又可省去标定碱液的操作。

蒸馏时，硼酸吸收液的温度不得超过40℃，否则会减弱对氨的吸收作用，这时检验人员可以通过加大冷凝管的进水量或将吸收液接收瓶置于冷水浴中的方式避免氨的逸出[5]。蒸馏结束后，检验人员可用pH试纸检查馏出液的方法来判断样品中的氨是否被完全蒸出。

2.4 滴定

蛋白质滴定过程中常用的标准酸滴定溶液有盐酸或硫酸。为保证蛋白质测定结果的准确性，标准酸滴定溶液必须严格按照标准《GB/T 601-2016化学试剂标准滴定溶液的制备》中规定的方法进行配制和标定[6]。

常用的混合指示剂有甲基红-亚甲基蓝指示剂、甲基红-溴甲酚绿指示剂两种。前者滴定终点颜色为灰蓝色，后者滴定终点颜色为浅灰红色[7]。

3 结语

实验室检验人员在使用凯氏定氮法测定速冻调制食品蛋白质含量时，应严格依照标准规定的流程进行样品处理、消化、蒸馏、滴定操作，才能保证最终蛋白质测定结果的真实性、可靠性。同时，检验人员应当注意凯氏定氮法并不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的速冻调制食品蛋白质的测定，此时要选择其他方法开展蛋白质的测定工作。