结肠癌中氨磷汀对顺铂的增敏作用及其肾脏的保护作用

刘梦洁,王文娟,姜丽丽(西安交通大学第一附属医院肿瘤内科,西安 710061;通信作者,E-mail:lingyinnancy@163.com)

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率在男性中位于第三,在女性中位于第二[1]。尽管近年来靶向治疗在结肠癌中得到了长足的进展,但手术结合术后辅助化疗仍为结肠癌的主要治疗方式。

顺铂是一种常见的化疗药物,用于多种肿瘤的治疗[2,3],它也是除5-氟尿嘧啶外另一种治疗结肠癌的常用化疗药物。顺铂具有较强的细胞毒性,可抑制肿瘤细胞的DNA复制过程,并破坏细胞膜结构,有较强的广谱抗癌作用。但是顺铂具有一定的毒副作用,对于身体虚弱者也会产生较大损伤,比如引发患者恶性呕吐、肾功能衰竭、手足抽搐等不良反应[4,5],制约了顺铂在临床上的应用[6]。因此,寻找增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性、降低顺铂对机体的毒性作用的方法十分重要。

目前关于化疗药物毒副作用的研究受到了广大学者的关注,相应地也提出了不少针对性的化疗保护剂,比如谷胱甘肽、硫代硫酸钠、右丙亚胺、氨磷汀等[2]。谷胱甘肽是一种天然的含疏基三肽,对于人体全身解毒和避免氧化剂损伤有着较强的作用,可以有效减轻顺铂导致的肾功能异常和神经毒性[3]。硫代硫酸钠主要解除患者局部使用大剂量顺铂时引发的毒副作用。右丙亚胺则主要针对化疗药阿霉素引起的心脏毒性进行防护,且不影响其抗肿瘤作用。氨磷汀又称阿米福汀,是一种半胱氨酸衍生的广谱细胞保护药物。由于在肿瘤患者接受化疗的过程中,正常组织细胞也会遭受到活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起的损伤,而氨磷汀几乎可以选择性保护所有正常组织免受放化疗损害,特别是烷化剂、铂类药物带来的不良反应[7]。近期的研究显示,氨磷汀在盆腔肿瘤患者的放疗过程中发挥着保护肠道和膀胱黏膜的作用[8],可以提高食管癌细胞对顺铂的敏感性[9]。但其对结肠癌细胞发挥的作用尚不明确。

因此,本研究通过体外细胞实验和裸鼠皮下移植瘤模型的构建,旨在探讨氨磷汀对顺铂的增敏作用及肾脏保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 本实验选用4周龄的雄性BALB/c裸鼠,共48只,均购买自西安交通大学实验动物中心。

1.1.2 实验细胞 小鼠结肠癌细胞CMT93和人结肠癌细胞SW620购买自中国科学院上海细胞库。

1.1.3 主要试剂及仪器 恒温CO2细胞培养箱(美国Themo Fisher Scientific公司);超净工作台(美国Themo Fisher Scientific公司);多功能酶标仪(德国BMG LABTECH公司);DMEM高糖培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(以色列Biological Industries公司);胰酶干粉(美国SIGMA公司);CCK-8试剂盒(美国Solarbio公司);肌酐试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司);尿素氮试剂盒(上海景源医疗器械有限公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 本研究所用的CMT93细胞和SW620细胞均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养,2-3 d传代一次。

1.2.2 CCK-8实验检测细胞活性 收集对数生长期的CMT93细胞和SW620细胞,以5 000个/孔的密度接种于96孔板中,待细胞贴壁后,用0,0.02,0.04,0.08,0.16 mg/L的顺铂分别与0,100,200,800 mg/L的氨磷汀联合处理CMT93细胞和SW620细胞,于培养24 h时在每孔加入15 μl的CCK-8试剂,再放入培养箱中避光培养4 h,取出96孔板,在450 nm波长处测定吸光度。通过Bliss法,结合各组细胞的OD值,计算氨磷汀与顺铂在体外的联合指数。

1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的构建及体内验证 为了明确氨磷汀联合顺铂在体内的作用,本研究将48只裸鼠随机分为两组,分别构建CMT93细胞皮下移植瘤模型和SW620细胞皮下移植瘤模型,每种模型24只;每种模型随机分为4组,分别为对照组、顺铂组、氨磷汀组、氨磷汀+顺铂组,每组6只。收集对数生长期的CMT93细胞或SW620细胞1×106个,用100 μl无血清DMEM培养基混匀,注射于裸鼠右侧臀部皮下。接种后第4天开始给予不同的处理:对照组腹腔注射250 μl的生理盐水;顺铂组腹腔注射4 mg/kg顺铂;氨磷汀组腹腔注射200 mg/kg氨磷汀;联合组腹腔注射200 mg/kg氨磷汀+4 mg/kg顺铂。四组均于第1,8,15,22天时分别进行上述处理,于第28天脱颈法处死小鼠。从接种开始检测移植瘤体积,绘制生长曲线,直至处理完毕处死小鼠,收集皮下移植瘤,称取移植瘤和裸鼠的质量;收集裸鼠肾脏并称取质量,计算肾脏指数(肾脏指数=肾脏质量/裸鼠质量×100%);收集外周血,检测血清中的肌酐及尿素氮。

1.2.4 统计学分析 本研究在SPSS22.0软件中进行统计分析。计数资料以平均数±标准差表示,两组数据差异性比较采用独立样本t检验。将P<0.05作为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氨磷汀在体外协同增强顺铂对结肠癌细胞的抑制作用

CCK-8检测各组细胞活性,结果显示:随着顺铂和氨磷汀单药浓度的增加,CMT93细胞和SW620细胞的活性逐渐降低,呈剂量依赖性;对于单药处理组,两药联合处理组CMT93细胞和SW620细胞的增殖抑制作用更加强烈(见图1)。通过Bliss方法计算得到两药联合指数分别为25.698(SW620细胞)和27.65(CMT93细胞),结果如图2所示:顺铂联合氨磷汀可以在体外协同抑制CMT93细胞和SW620细胞的增殖。

2.2 氨磷汀联合顺铂有效地抑制结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长

绘制各组小鼠移植瘤生长曲线,结果显示,顺铂组和联合组移植瘤生长较对照组受到了显著抑制;联合组移植瘤生长显著慢于顺铂组(见图3,4)。顺铂组和联合组移植瘤体积显著小于对照组(P<0.001);联合组移植瘤体积显著小于顺铂组(P<0.01,见图5);氨磷汀组移植瘤体积稍小于对照组,差异不具有统计学意义。顺铂组和联合组移植瘤质量显著小于对照组(P<0.001);联合组移植瘤质量显著小于顺铂组(P<0.001,见图6);氨磷汀组移植瘤质量稍小于对照组,差异不具有统计学意义。

A.SW620细胞皮下移植瘤大体标本B.CMT93细胞皮下移植瘤大体标本图3 各组皮下移植瘤大体标本Figure 3 The gross specimen of subcutaneou transplantation tumors in each group

与空白对照组相比,aP<0.01,bP<0.001;与顺铂组相比,cP<0.01,dP<0.001图4 各组皮下移植瘤生长曲线Figure 4 The growth curve of subcutaneou transplantation tumors in each group

与空白对照组相比,***P<0.001;与顺铂组相比,##P<0.01图5 各组皮下移植瘤体积Figure 5 The volume of subcutaneou transplantation tumors in each group

与空白对照组相比,***P<0.001;与顺铂组相比,###P<0.001图6 各组皮下移植瘤质量Figure 6 The weight of subcutaneou transplantation tumors in each group

2.3 氨磷汀减轻顺铂对裸鼠的肾损伤

采用肾脏指数和外周血尿素氮、肌酐水平评估氨磷汀对顺铂诱导小鼠肿瘤模型肾损伤的作用。结果显示,顺铂组小鼠肾脏指数较对照组显著增加(P<0.001);氨磷汀组小鼠肾脏指数与对照组无统计学差异;联合组小鼠肾脏指数较顺铂组显著下降(P<0.001,见表1)。顺铂组小鼠血肌酐和尿素氮的水平较对照组显著上升(P<0.001);氨磷汀组小鼠血肌酐和尿素氮的水平较对照组无统计学差异;联合组小鼠血肌酐和尿素氮的水平较顺铂组显著下降(P<0.001,见表2)。

表1 氨磷汀对小鼠肾脏指数的影响

表2 氨磷汀对小鼠外周血肌酐及尿素氮的影响 (mmol/L)

3 讨论

顺铂是临床上常用的非特异性抗肿瘤化学药物,使用的剂量越大,对肿瘤细胞的杀伤力越强,但因此而产生的毒性也越大。当顺铂进行人体后会由于肾脏器官的存储功能滞留造成肾毒性,所以常因发生急性肾损伤或肾衰竭而限制其临床应用。因此,如何在保证顺铂发挥正常疗效的同时并减缓乃至防止其诱发肾毒性是当前临床非常关注的问题[10]。

本研究首先在体外实验中选择了小鼠结肠癌细胞CMT93和人结肠癌细胞SW620,运用CCK-8实验评估了氨磷汀能否在细胞学水平上增强顺铂的抗肿瘤效果,结果显示氨磷汀与顺铂两药体外的联合指数分别为25.689(SW620细胞)和27.650(CMT93细胞),提示两药协同抑制结肠癌细胞的增殖。这说明,在达到同样抑制率的前提下,氨磷汀的使用可以减少顺铂的用量。

接着,本研究通过肾功能指标尿素氮、肌酐、肾脏指数来评估氨磷汀在顺铂对小鼠肿瘤模型肾损伤中的作用,结果显示顺铂组的尿素氮、肌酐、肾脏指数显著高于对照组(P<0.001),氨磷汀组尿素氮、肌酐、肾脏脏指数与对照组无显著性差异(P>0.05),氨磷汀联合顺铂组尿素氮、肌酐、肾脏指数显著小于顺铂组(P<0.001),这表明氨磷汀单独作用不会影响小鼠肿瘤模型肾脏功能,在与顺铂联合用药时可以有效改善顺铂引发的肾功能损伤,保护肾脏细胞的正常功能。

综上所述,本研究从动物水平和细胞学水平上分析了氨磷汀在小鼠结肠癌化疗中顺铂诱发肾损伤的保护作用及抗肿瘤效应。但是本研究还存在一些不足之处,所选取的小鼠样本量偏少,仍需要后续研究的验证。总而言之,化疗保护剂氨磷汀能够有效改善顺铂引发的肾功能损伤,提高正常细胞的存活率,并且能够协同增强顺铂在结肠癌细胞中的抗肿瘤效果。