DJ-1调控AMPK/mTOR信号在恢复糖尿病心肌对缺血后处理敏感性中的作用

2020-12-10 08:48余艳丽孟庆涛夏中元武汉大学人民医院麻醉科武汉430060通信作者mailxiazhongyuan2005aliyuncom
山西医科大学学报 2020年11期
关键词:后处理心梗心肌

周 斌,余艳丽,邱 珍,孟庆涛,夏中元(武汉大学人民医院麻醉科,武汉 430060;通信作者,E-mail:xia-zhongyuan2005@aliyun.com)

循证医学研究表明,糖尿病患者更易发生急性心肌梗死,即便恢复冠脉血流,其发生缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的程度更重,预后更差,死亡率更高[1]。缺血后处理(ischemia post-conditioning,IPO)被证实为抵抗心肌IRI行之有效的方案[2-4],然而,既往研究显示糖尿病患者心肌对IPO的保护作用失敏感[3]。我们前期研究发现,糖尿病患者心肌中DJ-1蛋白表达显著下降[5],进而导致心肌细胞自噬水平下降[6],这可能是糖尿病患者心肌IRI易损性增加且对IPO保护作用失敏感的重要原因,但其具体调控机制尚未阐明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在自噬的调控中发挥了重要的作用[7],此外,亦有研究表明DJ-1对AMPK具有调控作用[8]。因此,我们推测,DJ-1可能通过调控AMPK/mTOR信号通路介导自噬活性。本实验以糖尿病大鼠为研究对象,通过建立急性心肌IRI模型,探讨过表达DJ-1是否能恢复糖尿病心肌对IPO的敏感性,并试图阐明AMPK/mTOR信号及其下游自噬在此过程中扮演的角色。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备

链脲佐菌素、戊巴比妥钠、伊文思蓝和氯化苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC),AMPK抑制剂复合物C均购于美国Sigma公司,肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所,AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购于美国CST公司,荧光二抗购于美国Millpore公司。ALCV9型动物呼吸机购于上海奥尔科特公司,Odyssey红外扫描显影仪购于美国Li-Cor公司。

1.2 糖尿病模型制备

8周龄雄性SD大鼠,体质量210-250 g,购自湖南斯莱克景达有限公司,生产许可证号SCXK(京):2016-2019,批号:43004700023411。适应性饲养3 d,禁食12 h,参照文献[3]采用单次腹腔注射1%链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液(Sigma公司,美国)60 mg/kg的方法制备1型糖尿病模型。造模72 h断尾取血测定血糖,以空腹血糖浓度≥16.7 mmol/L,并出现多饮、多食、多尿和消瘦等症状为1型糖尿病模型制备成功。

1.3 动物分组

取制备成功的糖尿病模型大鼠60只,随机分为5组(n=12):缺血再灌注组(IR)、缺血后处理组(IPO)、心肌DJ-1过表达+缺血再灌注组(DIR)、心肌DJ-1过表达+缺血后处理组(DIPO),心肌DJ-1过表达+缺血后处理+AMPK通路抑制剂复合物C(DIPOC)。

1.4 重组腺相关病毒(rAAV)及复合物C的注射

DIR组和DIPO组糖尿病大鼠饲养5周时,参照文献[9]将携带DJ-1基因的心肌亲和腺相关病毒9型(rAAV9-CMV-DJ-1,汉恒生物)按2×1012vg/kg的剂量经尾静脉注射,3周后,腺相关病毒将达到表达高峰。DIPOC组大鼠于缺血前30 min尾静脉注射AMPK抑制剂复合物C 5 mg/kg。

1.5 缺血再灌注及缺血后处理模型的建立

糖尿病大鼠病程8周。腹腔注射0.9%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉后固定妥当,置皮下电极监测Ⅱ导联心电图。行气管切开术,动物呼吸机机械通气。IR组和DIR组于左锁骨中线处切开胸壁,分离冠状动脉左前降支(LAD)并穿线,稳定10 min,采用结扎LAD 30 min,再松开120 min的方法建立心肌IR模型;IPO组和DIPO组于再灌注前行3个循环的再灌注10 s/缺血10 s。

1.6 血清CK-MB含量检测

再灌注2 h时,心尖取血,4 ℃离心后取上清液,采用检测试剂盒检测血清CK-MB的水平。

1.7 心肌梗死面积的检测

每组随机选择6只大鼠,原位结扎LAD,经股静脉注射0.3%的伊文思蓝将心肌蓝染后,立即取心-20 ℃冷冻1 h,沿垂直于心脏长轴的方向将其切为2 mm的薄片,置于1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液中,37 ℃避光孵育20 min,中性甲醛固定20 min后扫描。采用Image-ProPlus 6.0软件测定心梗面积,白色区域为梗死区,砖红色区域为缺血危险区,以梗死区/缺血危险区面积的百分比表示心肌梗死范围(%)。

1.8 心肌DJ-1蛋白含量、AMPK/m TOR信号通路活性及自噬水平的检测

各组取6只大鼠心脏,进行常规的蛋白抽提、定量和变性,行SDS-PAGE电泳,蛋白湿转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,于兔抗鼠DJ-1、p-AMPK、p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和GAPDH抗体(稀释度1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜,于羊抗兔荧光二抗(稀释度1 ∶15 000)室温孵育1 h;使用Odyssey红外扫描显影仪扫描并分析测定灰度值,以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值比例表示目的蛋白表达水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 心梗面积与血清CK-MB水平

与IR组比较,IPO组心梗面积[(52.57±5.00)%vs(50.38±6.14)%]和血清CK-MB水平[(1 683.02±258.12)U/Lvs(1 574.12±264.19)U/L]变化无统计学差异(均P>0.05),而DIPO组心梗面积[(32.92±6.09)%]和CK-MB水平[(879.60±195.70)U/L]显著下降(均P<0.05)。IR组与DIR组间比较,上述指标差异无统计学意义(均P>0.05,见图1)。

与IR组比较,*P<0.05图1 各组再灌注后心梗面积和血清CK-MB含量比较 (n=6)Figure 1 Comparison of myocardial infarct size and serum CK-MB release among five groups (n=6)

2.2 心肌DJ-1表达,AMPK/mTOR信号及LC3Ⅱ/Ⅰ比值

IR组与IPO组之间比较,心肌DJ-1(1.00±0.00vs1.08±0.19)、p-AMPK(1.00±0.00vs1.08±0.19)、p-mTOR水平(1.00±0.00vs0.96±0.14)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值(1.00±0.00vs0.98±0.17)差异无统计学意义(均P>0.05)。腺相关病毒转染过表达DJ-1后,心肌DJ-1含量增加约3倍。与IR组比较,DIPO组心肌DJ-1(3.17±0.36),p-AMPK表达(2.19±0.37)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值(1.26±0.20)显著增加,p-mTOR(0.56±0.10)显著下降(均P<0.05);IR组与DIR组比较,上述指标差异无统计学意义(均P>0.05,见图2-5)。

与IR组比较,*P<0.05图2 各组心肌DJ-1表达情况 (n=6)Figure 2 Comparison of DJ-1 in myocardium among all five groups (n=6)

与IR组比较,*P<0.05;与DIPO组比较,#P<0.05图3 各组心肌p-AMPK表达情况 (n=6)Figure 3 Comparison of p-AMPK expression in myocardium among five groups (n=6)

与IR组比较,*P<0.05;与DIPO组比较,#P<0.05图4 各组心肌p-mTOR表达情况 (n=6)Figure 4 Comparison of p-mTOR expression in myocardium among five groups (n=6)

3 讨论

本研究参照文献[10]的方法建立1型糖尿病大鼠模型和心肌缺血再灌注模型,结果显示糖尿病大鼠血糖均高于16.7 mmol/L,且出现多食、多饮、多尿、体型消瘦等典型的糖尿病症状;大鼠心肌IRI后,其心梗面积和血清CK-MB水平显著增加,提示急性心梗模型建立成功。既往研究证实IPO能有效减轻非糖尿病大鼠的心肌IRI[2,3],然而本实验的结果提示,糖尿病心肌对IPO的保护作用失敏感,这与前期的研究结果相一致[3]。

与IR组比较,*P<0.05;与DIPO组比较,#P<0.05图5 各组心肌LC3Ⅱ/Ⅰ比值 (n=6)Figure 5 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ ratio in myocardium among five groups (n=6)

DJ-1是一种高表达于心肌的多功能蛋白,对维持心脏的正常生理活动具备重要意义[11]。前期研究证实,糖尿病心肌中DJ-1表达下调,并抑制其下游PTEN/PI3K/eNOS通路,这可能是糖尿病心肌氧化应激加重、IRI易损性增加且对IPO失敏感的重要原因[2],但具体调控机制仍未明确。此外,一项在H9c2细胞株上的研究发现,在高糖环境下,H9c2细胞的缺氧复氧损伤显著增加,且对缺氧后处理的保护作用失敏感,进一步探究发现,这与H9c2细胞中DJ-1低表达,继而细胞自噬抑制密切相关;而过表达DJ-1能显著提高细胞自噬,恢复缺氧后处理对H9c2细胞的保护作用。然而此过程中,DJ-1是通过何种机制调控自噬的尚未明确。

AMPK是一种高度保守的蛋白激酶,在调控机体能量代谢和对抗有害刺激等方面扮演了十分重要的角色[12]。研究证实AMPK调控的mTOR通路在自噬的调控中发挥了十分重要的作用。Guo等[13]的研究证实糖尿病心肌AMPK磷酸化水平显著下调,心肌自噬水平降低,这可能是糖尿病心肌病的重要机制。此外,亦有研究证实AMPK/mTOR调控的自噬在心肌缺血再灌注方面具有重要意义[14],值得关注的是,DJ-1被证实为AMPK的上游调控因子,尤其是在缺氧环境下[15]。在体敲除DJ-1后,AMPK/mTOR通路失活,其下游的自噬水平降低,从而加重高糖刺激引起的细胞凋亡和损伤[8]。基于此,我们推测,在糖尿病心肌中,DJ-1低表达降低AMPK/mTOR通路活性,继而抑制细胞自噬是糖尿病心肌对IPO的保护作用失敏感的重要原因。

在本研究中,我们利用基因干预技术,通过对糖尿病大鼠注射携带DJ-1基因的AAV9,实现糖尿病心肌DJ-1蛋白的过表达。AAV9介导的基因干预在心肌病的防治方面取得了良好的研究结果,具备广泛的研究前景[16]。AAV在注射后第3周达表达峰值,因本研究选取糖尿病病程8周的大鼠作为研究对象,故我们在糖尿病模型诱导成功后的第5周进行AAV注射,待其病程至第8周时,AAV表达已进入表达高峰。我们前期研究证实,AAV注射组糖尿病大鼠心肌DJ-1蛋白表达为非注射组对照组的3倍,证实AAV9介导的DJ-1过表达成功,并且DJ-1过表达能有效恢复糖尿病心肌对IPO的敏感性,在此过程中,p-AMPK水平增加、p-mTOR水平下降,说明AMPK/mTOR通路显著激活,且自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例明显上调,说明自噬水平增加。进一步研究发现,复合应用AMPK抑制剂复合物C可显著抑制AMPK/mTOR信号活性,抑制细胞自噬,逆转DJ-1过表达联合IPO对糖尿病IRI心肌的保护作用,这强烈提示,心肌过表达DJ-1通过激活AMPK/mTOR通路上调细胞自噬水平,从而恢复糖尿病心肌对IPO的敏感性。

综上所述,糖尿病状态下,DJ-1下调导致的自噬抑制是糖尿病心肌对IPO失敏感的重要原因,心肌过表达DJ-1可恢复其对IPO的敏感性,其机制可能与激活AMPK/mTOR信号通路,进而上调细胞自噬水平有关。

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