荧光增白剂CXT和CBS的物理化学性质及细胞毒性

姚苏霞,薛红波,王真祥,杜江锋(山西医科大学医学影像学院,太原 0000;山西省疾病预防控制中心卫生检验二科;山西青山化工有限公司研发部;通信作者,E-mail:xuehongbo00@6.com)

荧光增白剂(fluorescent brightener)能够吸收近紫外区域的光,并且发出蓝光的有机化合物,具有良好的染色功能[1]。作为一种特殊的染料,其通过光补偿的原理对发黄的织物进行增白,使织物在光照下产生的蓝光和黄色进行叠加,通过白度的明显增加,使物品显得更加洁白和亮丽。近年来,广泛应用于造纸、洗涤剂和涂料等多个领域[2]。随着人民环保意识的提高,人民群众越来越青睐浅色的衣物和纺织品,而荧光增白剂作为一种绿色环保的荧光染料,已经成为浅色织物保持亮丽和鲜艳不可或缺的一部分。荧光增白剂的广泛应用,使人们在工作和生活中与其接触的概率也明显增加;同时生产企业工作场所的内部和外部空气中也包含有大量悬浮的荧光增白剂粉尘,印染或者洗涤织物后,含有荧光增白剂的废水会进入环境中,这些有可能对人类的身体健康带来影响,因此荧光增白剂的生物安全性受到了人们越来越多的关注[3,4]。

作为“二苯乙烯基联苯类”和“双三嗪氨基二苯乙烯类”荧光增白剂的代表物,荧光增白剂CBS(染料索引编号:C.I.F.B.351)和荧光增白剂CXT(染料索引编号:C.I.F.B.71)及其不同剂型的衍生物,是目前在洗涤剂和印染领域应用最为广泛的两个品种。CBS和CXT具备良好的低温溶解性、物理化学性质稳定、增白效果均一、耐漂白等优异性能。近年来,随着合成洗涤剂,尤其是液体洗涤剂的飞快发展,对CBS和CXT的需求量越来越多,这也使人们对其生物安全性有了更多的担忧[5]。荧光增白剂的生物安全性评价应该综合考虑各个方面,包括其进入生物体后与蛋白质、DNA、组织、生物体液等体内组织的相互作用。虽然已有相关文献进行了报道[6-8],但是以前实验都是把动物作为实验研究对象,而在细胞层次的研究很少有报道。商品化的荧光增白剂中除了荧光增白剂成分以外,还有一些反应的副产物,有机溶剂和无机盐等,但是产品的主体成分的色谱纯度都在90%以上[9-11]。本文选用荧光增白剂CBS和CXT分别作为不同化学结构荧光增白剂的代表,使用人支气管上皮细胞16HBE和人正常皮肤角质细胞HaCaT分别作为研究对象,研究荧光增白剂对呼吸道细胞和皮肤细胞的生物安全性影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

荧光增白剂CBS和CXT(山西青山化工有限公司),纯度:CBS和CXT均大于95%;溶解荧光增白剂的超纯水(Milli-Q净水系统);细胞培养基RPMI-1640、DMEM、胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素(上海Gibco有限公司);细胞培养板(Corning中国有限公司);细胞活力检测试剂MTT(日本同仁化学研究所);DCFH-DA和凋亡检测试剂盒(上海前尘生物科技有限公司);其余化学试剂均购自北京化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪(美国安捷伦1260),细胞培养箱(Thermo公司Forma Series II),流式细胞仪C6(美国BD公司),红外线染色机(美国SDL ATLAS公司ECO),Zetasizer Nano S90(英国马尔文仪器有限公司),酶标仪(Tecan公司TECAN Infinite M200),分光测色仪(美国HunterLab公司UltraScan PRO),扫描电子显微镜(日立S-4800),岛津高效液相色谱仪SPD-10AVP,荧光倒置显微镜(奥林巴斯IX71),全自动卡尔费休水分仪(瑞士C30)。

1.3 物理化学性质表征分析

配备10 μg/ml的CBS和CXT溶液,然后装在专用的比色皿中用以检测粒径分布和Zeta电势,分别将CBS和CXT固体粉末涂抹在专用胶带上,使用倒置显微镜对其表面形貌进行分析,同时将CBS和CXT的水溶液滴在专用胶带上,待其晾干后,使用倒置显微镜再次观察材料析出后的表面形貌。使用C18反相柱,以甲醇和水为流动相,分析CBS和CXT的色谱纯度。使用红外染色法对两种荧光增白剂对棉布的增白强度进行分析。水不溶物按照目视判定法进行判定,使用紫外分光光度计对消光系数进行检测,荧光增白剂所含水分使用全自动水分仪进行检测。使用红外线试色机对棉布进行染色,利用白度测定仪对荧光增白剂的增白效果进行测定。

1.4 细胞毒性检测

分别称量不同质量的荧光增白剂CBS和CXT,然后搅拌溶解在超纯水中,配置成不同浓度的液体(0,10,25,50,100,200,400,600,800,1 000 μg/ml)待用。人支气管上皮细胞16HBE和人正常皮肤角质细胞HaCaT分别使用RPMI-1640和DMEM完全培养基培养,培养基中含有10%的血清和1%的青霉素-链霉素。所有细胞的培养都维持在37 ℃、含有5%CO2的湿润条件中。16HBE细胞和HaCaT细胞首先在培养皿中进行培养,当培养至第5天时,在96孔板中,每孔接种约8 000个细胞。培养24 h后,将不同浓度的CBS和CXT溶液(0,10,25,50,100,200,400,600,800,1 000 μg/ml)加入到96孔板中与细胞进行孵育,孵育24 h后,将上清液吸出,使用磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)清洗3遍,然后加入MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)试剂,细胞培养箱内继续培养30 min-2 h,然后加入二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞内生成的结晶紫,使用酶标仪检测细胞液在490 nm处的吸光度。

1.5 细胞凋亡实验

通过研究与荧光增白剂作用后的细胞凋亡情况,可充分反映荧光增白剂对细胞是否会产生急性或慢性毒性。首先我们将16HBE和HaCaT细胞被分别接种在6孔板中,细胞接种密度为5×104个,分别使用RPMI-1640和DMEM完全培养基进行培养,然后将所有的孔分成4组,每组平行3个孔。4个组分别为:对照组、50 μg/ml荧光增白剂组、100 μg/ml荧光增白剂组,200 μg/ml荧光增白剂组。当六孔板中的细胞密度长到80%时,各个荧光增白剂组分别与对应浓度的材料孵育24 h,然后将绿色荧光标记的Annexin Ⅴ和PI工作液加入到六孔板中,染色1 h,绿色荧光标记的Annexin Ⅴ可以与细胞膜外翻后暴露的磷酯酰丝氨酸结合,反映细胞早期和晚期凋亡情况,可产生红色荧光的PI可以穿过破坏的细胞膜进入细胞核,和染色质结合,反应细胞晚期凋亡情况。将细胞消化、离心洗涤3次,弃掉游离的绿色荧光标记的Annexin Ⅴ和PI,使用流式细胞仪检测细胞不同荧光的强度,绿色荧光代表细胞发生早期凋亡、红色荧光代表细胞发生晚期凋亡。Q1-LL区域代表正常细胞,Q1-LR区域代表早期凋亡细胞,Q1-UR代表晚期凋亡细胞,Q1-UL区域代表坏死细胞。

2 结果

2.1 荧光增白剂的物理化学性质

荧光增白剂CBS和CXT及其不同剂型的衍生物的分子式见图1。我们分别对其消光系数、棉布增白强度、含水量、水不溶物、色谱纯度和Zeta电势进行了检测,检测结果见表1。

图1 荧光增白剂CXT和CBS及其不同剂型的分子结构式Figure 1 The formula of fluorescent brighteners CXT and CBS

表1 荧光增白剂CXT和CBS的物理化学参数

从表1中可以看出,实验选取的两种荧光增白剂各项指标均符合产品出厂的各项检测指标,色谱纯度均在95%以上,对棉布的增白强度也都达到了99%以上,具有良好的染色效果。Zeta电势结果显示,CXT和CBS荧光增白剂的电势-23.8 mV和-13.8 mV。荧光增白剂CBS和CXT从水溶液中析出后,显微镜图片显示CBS其呈块状、大小尺寸不一,但具有明显的晶体结构(见图2A)。CXT呈均匀细小的粉末状,无明显的晶体结构(见图2B)。扫描电子显微镜图片显示,荧光增白剂CBS为众多细小的薄片层状结构堆积形成的团块结构(见图2C),荧光增白剂CXT为小颗粒和大块状材料的混合体,但是整体的尺寸要明显小于荧光增白剂CBS(见图2D)。动态光散射仪结果显示荧光增白剂CBS溶液的水合粒径约为136.6 nm(见图3A),CXT溶液的水合粒径约为122.3 nm(见图3B)。

A.荧光增白剂CBS粉末的显微镜成像 B.荧光增白剂CXT粉末的显微镜成像 C.荧光增白剂CBS粉末的扫描电子显微镜成像 D.荧光增白剂CXT的SEM成像图2 荧光增白剂CBS和CXT的形貌Figure 2 Morphology of fluorescent brighteners CBS and CXT

A.荧光增白剂CBS的水合粒径 B.荧光增白剂CXT的水合粒径图3 动态光散射仪检测荧光增白剂CBS和CXT溶于水后的粒径分布Figure 3 The size distribution of fluorescent brighteners in water by dynamic light scattering

2.2 荧光增白剂的细胞毒性结果

细胞活力研究结果显示16HBE和HaCaT细胞有着浓度依赖效应的毒性(见图4)。但这两种细胞的耐受性还是有明显的区别,对于荧光增白剂CBS,当其浓度达到100 μg/ml时,16HBE细胞的细胞活力下降到了80%左右;而对于荧光增白剂CXT,当其浓度达到100 μg/ml时,16HBE细胞的细胞活力下降到了90%左右。而相对于HaCaT细胞,当荧光增白剂CBS和CXT浓度均达到600 μg/ml时,其细胞活力下降到了80%左右。

我们使用显微镜观察了细胞形态结构的变化,发现在与200 μg/ml浓度的CBS和CXT作用24 h后,除极少量细胞死亡悬浮的培养液的上层,大部分的细胞形态并未发生明显改变(见图5)。

图4 不同浓度荧光增白剂CBS和CXT对16HBE和HaCaT细胞活力的影响Figure 4 The cell viability of 16HBE and HaCaT cells after cultured with various concentrations of fluorescent brighteners for 24 h

A.16HBE细胞正常形态;B.16HBE细胞与200 μg/ml荧光增白剂CBS溶液作用24 h;C.16HBE细胞与200 μg/ml荧光增白剂CXT溶液作用24 h;D.HaCaT细胞正常形态;E.HaCaT细胞与200 μg/ml荧光增白剂CBS溶液作用24 h;F.HaCaT细胞与200 μg/ml荧光增白剂CXT溶液作用24 h图5 荧光增白剂CBS和CXT对16HBE和HaCaT细胞形态结构的影响Figure 5 The morphology of 16HBE and HaCaT cells after incubation with fluorescent brighteners CBS and CXT

流式细胞仪联合凋亡试剂检测结果显示,无论是对于16HBE细胞还是HaCaT细胞,荧光增白剂CBS和CXT浓度即使达到200 μg/ml,也均未诱导细胞凋亡(见图6-9)。

图6 不同浓度荧光增白剂CBS对16HBE细胞的凋亡影响Figure 6 Effect of fluorescent brighteners CBS on apoptosis of 16HBE cells by flow cytometric analysis

图7 不同浓度荧光增白剂CBS对HaCaT细胞的凋亡影响Figure 7 Effect of fluorescent brighteners CBS on apoptosis of HaCaT cells by flow cytometric analysis

图8 不同浓度荧光增白剂CXT对16HBE细胞的凋亡影响Figure 8 Effect of fluorescent brighteners CXT on apoptosis of 16HBE cells by flow cytometric analysis

图9 不同浓度荧光增白剂CXT对HaCaT细胞的凋亡影响Figure 9 Effect of fluorescent brighteners CXT on apoptosis of HaCaT cells by flow cytometric analysis

3 讨论

荧光增白剂CBS和CXT每年产量的大部分都被用在洗涤剂领域,如被添加在洗衣粉、洗衣液、肥皂和皂粉中,广泛的应用在人民群众的日常生活中,所以研究其潜在的毒理学特征具有重要的意义。本文分别选取了呼吸系统中的16HBE细胞和皮肤系统中的HaCaT细胞做为研究对象,以评价荧光增白剂对呼吸系统和皮肤系统的毒理学效应。

首先,我们分别使用倒置显微镜、扫描电子显微镜和粒度分布仪对两种荧光增白剂的形貌、尺寸和电势进行了检测,这3个指标对于荧光增白剂的溶解性均有一定的影响。一般来讲,电势负值越大,其溶解性越好。但实验过程中发现荧光增白剂CBS的溶解性要明显好于CXT,这是因为荧光增白剂CBS的晶型结构、片层式堆积更有利于其溶解。这说明,在这两种荧光增白剂中,晶型结构对溶解性起着更为关键的作用。荧光增白剂CBS和CXT的水合粒径与棉布的纤维间隙较为匹配,使得荧光增白剂分子在洗涤过程中能够有效的“镶嵌”在布料中,从而达到增白的效果。研究显示,材料的尺寸对其生物效应有着重要的影响[12]。荧光增白剂的尺寸大小对细胞摄入和外排效应也有一定的影响,因此检测荧光增白剂的大小和尺寸就显得极为重要。

紧接着,我们选取荧光增白剂CBS和CXT不同浓度的溶液(50,100,200 μg/ml)用来研究其对16HBE细胞和HaCaT细胞活力和凋亡坏死的影响,以了解荧光增白剂对细胞的毒理学效应。MTT法是一种经典的细胞活力评价手段,检测结果说明荧光增白剂CBS相对于CXT,其对呼吸系统的毒性更为明显,而对皮肤系统来讲,这两种荧光增白剂没有明显的区别。这说明皮肤角质形成细胞的耐受性要优于呼吸系统的细胞,这和细胞自身的生理功能也有着密切的关系。相对于呼吸系统的上皮细胞,角质形成细胞可以产生增强皮肤硬度和防水功能的角蛋白,有效地抑制其对荧光增白剂的摄入,进而降低外来物质对机体的损伤。细胞形态学的结果显示,无论是荧光增白剂CBS还是CXT,即使在200 μg/ml的浓度下,所有的细胞正常排列接触生长,细胞体积未明显缩小,胞膜完整无小泡,这说明荧光增白剂并不会对细胞的形态产生明显的影响。

当细胞与能引起损伤的因子作用到一定强度或持续一定时间时,细胞会分泌一些产物调控细胞发生程序性死亡而不伴随炎症的发生,如细胞膜表面出现囊泡、细胞膜外翻等,从而保护机体的健康,这个过程叫做细胞凋亡。在凋亡阶段,细胞膜的通透性未发生明显改变,所以只有绿色荧光素标记的Annexin Ⅴ可以与早期和中期凋亡的细胞结合,而发射红色荧光的PI染料不会进入细胞对细胞核染色。细胞坏死是受到了强烈的理化或生物因素影响,导致细胞无序变化的一种死亡过程,其细胞膜被破坏,细胞核内染色体发生浓缩、碎裂或者溶解分解,此时PI可以进入细胞核对DNA进行染色。因此,利用流式细胞仪结合凋亡试剂盒检测细胞凋亡是一种经典可靠的评价细胞毒性的手段。正常的细胞中,磷酯酰丝氨酸只分布在细胞膜的内侧,当细胞发生凋亡早期时其会外翻至胞膜外侧,从而与荧光素标记的Annexin Ⅴ结合。PI不能透过完整的细胞膜,但是可以进入处于凋亡晚期的细胞核内,进而将细胞核染红。细胞凋亡的流式数据进一步证实了前述结论,即使在200 μg/ml荧光增白剂的作用下,也未出现明显的细胞凋亡,这说明荧光增白剂CBS和CXT在和呼吸道或者皮肤表层细胞发生接触后,只是降低细胞的活力,不能破坏细胞膜的完整性。以上结论证实荧光增白剂对细胞的影响是一种温和的、缓慢的刺激,可能会降低线粒体的功能,导致细胞活力降低,但是不会使细胞发生凋亡。

一般来讲,荧光增白剂CBS或者CXT在洗涤剂生产中的添加量一般为0.01%-0.4%,而洗涤剂在实际使用时还会再被稀释100-1 000倍,即荧光增白剂最终与消费者接触时的浓度仅有4-40 μg/ml。在该浓度条件下,无论是CBS还是CXT,均不会对呼吸道或者皮肤表面的细胞造成毒性损伤。但对于直接暴露在荧光增白剂粉尘中的职业人员来讲,还是需要做好一定的防护措施,以防止工人直接暴露于高浓度的荧光增白剂粉尘中。