基于SUR1基因探讨川芎嗪治疗创伤性脑损伤的机制

余 万,葛玉元,张 勇(南京中医药大学附属中西医结合医院神经外科,南京 210028;通信作者,E-mail:kayaxi@qq.com)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是指头部突然受到外界暴力而引起的脑部结构破坏或功能紊乱,常由车祸、坠落、矿难等因素所致[1]。TBI由于其高致死率和重残率,对公众健康造成了严重威胁。

中医学认为“血瘀”为脑损伤的基本病机,在《素问·调经论篇》“病在脉、调之血,病在血、调之络”理论指导下,运用络病理论探讨TBI损伤机制将显得尤为重要。

川芎嗪是从川芎根基中提取分离的生物碱单体,可通过抑制血小板凝聚聚集而降低血液黏度,还具有改善微循环和血管扩张、抗炎和清除自由基等作用,从而发挥其脑组织保护作用[2-4]。现阶段,对于治疗TBI药物的机制研究,主要着眼点集中于气、血、水某一方面,而结合中医络病学气血水同治理论,开展治疗TBI药物作用机制的研究较为少见。针对川芎嗪活血化瘀的特点,本研究基于中医络病学气血水同治理论,以磺酰脲受体1(SUR1)基因为研究着眼点,探讨川芎嗪治疗TBI的作用机制,为临床开发安全有效的TBI治疗药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

注射用盐酸川芎嗪(平光制药股份有限公司,中国);白介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒购自上海纪宁实业有限公司(中国);抗体SUR1、M4型瞬时受体电位通道(TRPM4)、水通道蛋白4(AQP4)、丝裂原激活的蛋白激酶p38(p38 MAPK)和磷酸化p38(p-p38)购自Abcam公司(英国);HRP标记的GAPDH抗体和HRP标记的二抗分别购自数谱(上海)生物科技有限公司(中国)和Santa Cruz公司(美国);SPF级ICR雄性小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,体质量18-22 g。

1.2 方法

1.2.1 TBI小鼠模型制作、分组和给药 SPF级ICR雄性小鼠60只,随机分为假手术组、模型组和川芎嗪低(15 mg/kg)、中(30 mg/kg)、高(60 mg/kg)剂量组,每组12只。

采用水合氯醛(5 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,按文献[5]方法采用Feeney自由落体撞击法制作TBI小鼠模型(开颅窗后给予颅脑撞击)。假手术组开颅窗后不给予颅脑撞击。手术过程中采用小动物监护仪检测小鼠生命体征,使用加热板将小鼠体温维持在37 ℃,头皮缝合后,将动物放回动物房。剔除死亡和未造模成功的小鼠后,将TBI小鼠随机分成模型组和川芎嗪低(15 mg/kg)、中(30 mg/kg)、高(60 mg/kg)剂量组,每组10只,另外取10只小鼠作为假手术组(开颅窗后不给予颅脑撞击)。损伤2 h后给药组小鼠腹腔注射相应剂量的川芎嗪,每天1次,而假手术组和模型组小鼠给予等量生理盐水,连续给药7 d。分别对小鼠进行神经功能缺损评分、脑组织含水量、炎症因子和相关蛋白表达水平进行测定。

1.2.2 神经功能缺损评分 按文献[6]方法采用改良神经功能缺损评分(mNSS)对小鼠进行运动感受及反射功能检查,最高分为18分,分值越高代表损伤越严重,于建模损伤后1,3,7 d进行评分。

1.2.3 脑组织含水量测定 采用干湿重法测脑组织含水量,脑含水量=(脑组织湿重-干重)/脑组织湿重×100%。

1.2.4 脑组织炎症因子水平的测定 第7天进行mNSS评分后,采用颈椎脱臼法处死小鼠,取出脑组织后按照试剂盒说明书测定IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.2.5 脑组织SUR1、TRPM4、AQP4、p38、p-p38蛋白表达水平的测定 取损伤周围的脑组织,加入RIPA裂解液提取总蛋白,按照文献[6]方法,采用Western blot方法测定脑组织SUR1、TRPM4、AQP4、p38、p-p38和GAPDH蛋白的含量,蛋白经10% SDS-PAGE电泳分离后,转移到PVDF膜,然后在5%脱脂奶粉中封闭2 h,分别加入一抗SUR1(1 ∶2 000)、TRPM4(1 ∶2 000)、AQP4(1 ∶2 000)、p38(1 ∶2 000)、p-p38(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶5 000)4 ℃孵育过夜。PVDF膜经0.5% TBS-T溶液洗膜后再与HRP标记的二抗(1 ∶5 000)进行反应。洗膜后加入发光液后进行发光显色并进行灰度值分析,计算目的蛋白与GAPDH的灰度比值。

1.3 数据处理及统计

2 结果

2.1 川芎嗪对TBI小鼠mNSS的影响

与假手术组相比,第1,3,7天模型组小鼠mNSS显著升高(P<0.001),表明TBI模型建立成功;与模型组相比,损伤后第1天川芎嗪中、高剂量组小鼠的mNSS均显著降低(P<0.05),损伤后第3天,川芎嗪低、中、高剂量组小鼠的mNSS均显著降低(P<0.05-0.01),而损伤后第7天,川芎嗪低、中、高剂量组小鼠的mNSS也均显著降低(P<0.05-0.001),且各时间点中川芎嗪低、中、高剂量组mNSS逐渐降低,两两比较的差异有统计学意义(P<0.05),具有剂量依赖性(见图1)。

2.2 川芎嗪对TBI小鼠脑组织含水量的影响

与假手术组相比,模型组小鼠脑组织含水量显著升高(P<0.05),而与模型组相比,川芎嗪中、高剂量组小鼠脑组织含水量显著降低(P<0.05,见图2)。

与假手术组比较,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图1 不同时间点川芎嗪对TBI小鼠mNSS的影响Figure 1 Effect of tetramethylpyrazine on mNSS of TBI mice at different time points

与假手术组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05图2 川芎嗪对TBI小鼠脑组织含水量的影响Figure 2 Effect of tetramethylpyrazine on brain water content in TBI mice

2.3 川芎嗪对TBI小鼠脑组织炎症因子含量的影响

与假手术组相比,模型组脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著提高(P<0.01),而与模型组相比,川芎嗪中、高剂量组TBI小鼠炎症因子的含量显著降低(P<0.05-0.01),且川芎嗪中高剂量组炎症因子逐渐降低,两两比较的差异有统计学意义(P<0.05),具有剂量依赖性(见图3)。

与假手术组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图3 川芎嗪对TBI小鼠脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响Figure 3 Effect of tetramethylpyrazine on the contents of IL-1 β, IL-6 and TNF-α in brain tissue of TBI mice

2.4 川芎嗪对TBI小鼠脑组织SUR1及其下游靶蛋白表达的影响

与正常组相比,模型组小鼠脑组织SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表达显著上升(P<0.01),而川芎嗪中、高剂量可以显著降低TBI小鼠脑组织SUR1及其下游靶蛋白-TRPM4、AQP4和p-p38的表达(P<0.05-0.01),且川芎嗪中高剂量组相关蛋白表达逐渐降低,两两比较的差异有统计学意义(P<0.05),具有剂量依赖性(见图4)。

与假手术组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图4 川芎嗪对TBI小鼠脑组织SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表达的影响Figure 4 Effect of tetramethylpyrazine on the expression of SUR1, TRPM4, AQP4 and p-p38 proteins in brain tissue of TBI mice

3 讨论

现代研究证实,TBI后可引起脑微血管微循环障碍[7],改变了血液的密度和流动,而呈现血瘀的病理表现[8];同时,TBI早期就存在脑微血管内皮细胞功能和结构的改变[9],颅脑损伤时,受损区域VEGF表达增高[10],血管活性物质作用在酪氨酸激酶VEGFR1和VEGFR的作用下[11],使得血管内皮通透性提高,导致血管源性脑水肿的发生[12],造成“水积”,即血瘀兼“水积”象,这与中医的“津血同源”“汗血同源”“精血同源”观点不谋而合,而脑水肿是TBI后病情恶化和导致死亡的重要原因之一[13],有效控制和减轻TBI后脑水肿的发展对于提高TBI的救治水平有着举足轻重的意义;而炎症在TBI的病理过程中促进继发性脑损伤的发展,导致神经元的凋亡和神经功能的缺失,这与中医的“气”具有高度相关性[14]。因此,络病是指以人体络脉系统为基础的网络病变的概括,涉及人体多因素、多机制、多环节后导致人体多部位损伤而出现的病理或异常功能状态,而气血水同治是治疗脑络损伤的基本法则。

SUR1是一种由ABCC8编码的磺酰脲类受体和跨膜蛋白,在损伤的脑组织中表达升高[15],其基因的多态性对TBI引起的脑水肿的发生发展起到至关重要的作用[16]。在大鼠局灶性脑缺血模型中,发现SUR1和TRPM4形成SUR1-TRPM4通道,活性增强,引起了大鼠脑微血管微循环障碍,并呈现出“血瘀”的发现,而加入SUR1抑制剂后,可显著改善损伤的脑微血管微循环障碍[17],而近年来研究证实,保护微血管是防治心脑血管病的重要靶点[18]。AQPs是一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白,在脑组织中,AQP4参与脑内水平衡的调节,功能最重要,与外伤性脑水肿的发生密切相关[19],而最新研究结果表明,在颅脑损伤引起的星形胶质细胞肿胀和脑水肿中,AQP4与SUR1-TRPM4形成复合物,从而加速脑水肿的进程,如果抑制SUR1的表达,可以显著改善星形胶质细胞肿胀和脑水肿的发生发展[20]。在脑神经系统体外研究中发现,SUR1激活p38/MAPK通路,可以激活炎症的释放,从而影响脑神经的修复和再生[21]。因此,SUR1基因可从气、血、水三个方面影响颅脑损伤的发生发展,契合中医络病学气血水同治理论,本研究中发现TBI小鼠脑组织SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表达显著上升,提示其可能是治疗TBI的重要核心靶点。

研究发现,在TBI中,川芎嗪可以通过抑制核转录因子-κB信号通路,从而降低小胶质细胞和星形胶质细胞炎症因子的表达[22],同时川芎嗪注射液对颅脑损伤模型兴奋性氨基酸谷氨酸、天门冬氨酸含量有降低作用,对脑损伤的治疗具有一定的作用[23]。而在中风患者脑损伤中,川芎嗪作为活血化瘀药可以促进损伤的脑神经进行修复,有助于脑功能的恢复[24]。本研究发现川芎嗪可以显著降低TBI小鼠的mNSS评分、脑组织含水量和脑组织炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,表明川芎嗪对TBI具有比较好的治疗效果。同时研究发现川芎嗪可以降低TBI小鼠脑组织SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表达水平,提示川芎嗪可能通过调控SUR1,从而调控其下游靶蛋白-TRPM4、AQP4和p38,进而从气、血、水三个方面同时改善TBI。

现阶段,对于治疗TBI药物的机制研究,主要着眼点集中于气、血、水某一方面,而结合中医络病学气血水同治理论,开展治疗TBI药物作用机制的研究较为少见。本研究以SUR1基因为研究着眼点,探讨川芎嗪治疗TBI的作用机制,为临床开发安全有效的TBI治疗药物和中药现代化奠定了理论基础。