基于焦磷酸测序分析技术的金银花掺伪鉴别方法研究

徐石勇,赵新,张富丽,刘征辉,史清洪,宋君,王永,兰青阔*

1.天津市农业科学院, 天津 300381； 2.四川省农业科学院分析测试中心, 成都 610066； 3.天津大学, 天津 300072

金银花为忍冬科(caprifoliaceae)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初开的花，又名忍冬，是常用大宗中药材[1]，药用价值较高，具有清热解毒、宣散风热等功效[2-3]，常用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛[4]等症。近年来,由禽流感、甲型流感、非典、手足口病、新型冠状病毒[5-6]等病毒性疾病引起的全球季节性传染病爆发频繁。虽然金银花的开发利用获得了突破性进展，但优良品种相对较少，各地栽培品种各不相同，品种比较混杂，同物异名、同名异物的现象在不同地区时有发生[7-8]。于是一些不法商人便将价格便宜近10倍的红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand-Mazz.)、华南忍冬(LoniceraconfuseDC.)、黄褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)等山银花(LoniceraeFlos)当做正品的金银花销售并使用[9-10]。为了确保临床疗效安全和消费者的权益，目前亟需建立科学性强、精准度高、实用方便的金银花掺伪鉴别方法。

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是应用于DNA序列分析的新一代检测技术，是目前少数能进行实时、定量分析InDel/SNP标记等短片段变异的新型技术[11-12]。该技术先对目标区域进行PCR扩增，再对PCR产物进行测序[13]。在测序体系中，通过检测光的释放和强度，达到实时测定InDel/SNP不同基因型含量的目的。

本文基于SNP标记技术，结合焦磷酸测序分型分析技术，期望建立精准度高、通量大、便于应用的金银花掺伪量的检测方法，能够在短时间内完成金银花真伪及掺伪量的鉴定工作，为现代中药掺伪鉴定开辟新的检测技术。

1 材料和方法

1.1 实验材料

金银花及其常见的伪品华南忍冬、黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬、红腺忍冬等山银花标准品，均由天津海世达检测技术有限公司提供，研磨后提取DNA。

从河南、河北、山东等金银花主栽地区获得50份样品见表1，市场销售的含有金银花(或山银花)成分的15份中成药见表2。

表1 金银花主栽地区的50份样品情况Table 1 The 50 dominant variety of honeysuckle in the main planting area

续表序号品种来源加工方法外观A43金银花巨鹿县市场——A41金银花巨鹿县市场——A44金银花巨鹿县市场——A45金银花巨鹿县市场——A46金银花平邑县市场——A47金银花平邑县市场——A48金银花封丘县市场——A49金银花封丘县市场——A50金银花封丘县市场——

表2 15份市售含有金银花(或山银花)成分的中成药Table 2 15 commercial TCM containing honeysuckle or Lonicerae Flos natural ingredients

1.2 试剂与仪器

CTAB、Tris-HCl购自Sigma公司；Na2EDTA购自SbaseBio公司；DL 2000 DNA Marker、20 bp DNA Marker购自TaKaRa公司；GoTaq© Master Mix溶液购自Promega公司；树脂型基因组DNA提纯试剂盒购自赛百盛公司；Sepharose Bead购自Biotage公司；氯化钠、无水乙醇、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、冰乙酸均为国产分析纯；引物由上海生工生物公司合成。

焦磷酸测序仪(Biotage PyroMark ID)；PCR仪(伯乐CFX96)；凝胶成像系统(伯乐C150)；电热恒温水浴锅(NESLAB EX-111)；高速离心机(Thermo LEGND MICRO 21R)；水平电泳仪(伯乐Powed PAC200)；微量分光光度计(Nanodrop ND-1000)；生物粉碎仪(Retsch MM400)。

1.3 实验方法

1.3.1基因组DNA提取 选取金银花样品的完整花蕾，使用生物粉碎仪进行充分研磨，加入CTAB裂解缓冲液(20 g·L-1CTAB，1.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1Na2EDTA)500 μL，65℃进行恒温水浴裂解30 min，后续DNA提取纯化用树脂型基因组DNA提纯试剂盒进行操作。DNA提取后浓度统一稀释至(50±1)ng·μL-1。

1.3.2SNP位点引物设计 对金银花及其常见伪品的相关序列进行对比分析，在34、95、110、120、194、568、579、584、599、610、628、633、756、920、929处共15个候选SNP位点，其中633处SNP(A/C)位点能够区分金银花及其伪品(图1)。

图1 忍冬属候选SNP位点部分分析结果Fig.1 The analysis results of honeysuckle candidate SNP site

依据前面挖掘的SNP差异性位点设计出2条PCR扩增特异性引物和1条焦磷酸测序引物，引物由上海生物工程公司合成(表3)。

表3 本研究用到的引物序列Table 3 Primer sequence used in this study

1.3.3PCR扩增反应体系及扩增程序 扩增反应体系为(50 μL)：2×GoTaq© Master Mix25 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，模板DNA 2 μL，用灭菌去离子水补齐。反应程序：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环50次；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.3.4测序反应体系及结果分析 测序反应的总体积为100 μL，包括PCR产物50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer(10 mmol·L-1Tris-HCl，2 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.1% Tween20，pH 7.6)47 μL，10 μmol·L-1测序引物1.2 μL，Annealing Buffer(20 mmol·L-1Tris-AC，2 mmol·L-1MgAc2，pH 7.6)38.8 μL；测序时间8～10 min。

测序完成后使用“SNP”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第2个测序碱基“T”和第3个测序碱基“G”的光信号，系统自动对该位点进行分型，其中 “G/G”代表样品为金银花正品，“T/T”代表样品为金银花伪品。

测序完成后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第2个测序碱基“T”和第3个测序碱基“G”的等位基因频率判定测试样品中金银花含量中的掺伪量，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，“T”和“G”百分含量的和为1。

2 结果与分析

2.1 金银花与山银花标准品PCR结果

用金银花和山银花标准品的基因组DNA为模板，对差异性SNP位点进行PCR扩增，扩增结果显示(图2)，PCR扩增产物电泳条带大小一致，与预期大小相符，电泳条带单一、清晰、明亮且没有二聚体产生，说明设计的PCR引物位点和扩增效率较好，模板和PCR体系正常。其中，A1-A16均有扩增产物，条带清晰明亮，说明PCR引物位点和主产区金银花SNP位点扩增效率较好；B1-B15中有的没有扩增产物或是条带模糊，说明差异性SNP位点没有扩增出来。

2.2 金银花与山银花标准品SNP差异性位点焦磷酸测序分析

焦磷酸测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技术。产生的光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，依据加入的dNTP类型和测得的光信号强度就可以实时记录模板DNA的核苷酸序列。以金银花及山银花标准品的基因组DNA为模板，对差异性SNP位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析，短柱形代表一个光信号，表明此处有一个对应的碱基，长柱形代表有两个相同的光信号，表明此处有两个相对应的碱基，测序结果见图3。从图3中可以看出，金银花真品的核酸序列为5’-TGGAACCGCT-3’，分型为G/G，而山银花的核酸序列为5’-TTGAACCGCT-3’，分型为T/T，金银花伪品(50%)的核酸序列为5’-TT/GGAACCGCT-3’，分型为G/T。第1位碱基C和第4位碱基T为阴性质控位点。

图3 金银花与山银花SNP差异性位点焦磷酸测序结果Fig.3 Schematic results of pyrosequencing on SNP differential loci of honeysuckle and Flos lonicerae

焦磷酸测序通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比，这样就可以实时记录模板DNA的核苷酸序列，金银花、山银花(金银花伪品)及金银花掺伪品(50%)扩增产物焦磷酸测序结果见图4。

取部分产地及市场采购金银花和市场采购含有金银花中成药扩增产物进行焦磷酸测序，同时可准备96个样品的PCR产物，放入焦磷酸测序仪的96孔板中进行测序检测，其测序结果见图5。有3个T/T型金银花伪品，2个G/T型金银花掺伪品(50%)，其余均为G/G型金银花真品。

图5 部分样品的焦磷酸测序结果Fig.5 The pyrosequencing result of the part of sample

注：标注A1-A16为主产区采集的花组织DNA提取结果, 标注B1-B15的为市场采集的中成药DNA提取结果。图2 扩增产物的电泳分析图谱Fig.2 Electrophoretic analysis of PCR

A:金银花真品扩增产物的焦磷酸测序结果; B:金银花伪品扩增产物的焦磷酸测序结果; C:金银花掺伪品(50%)扩增产物的焦磷酸测序结果图4 PCR扩增产物焦磷酸测序结果Fig.4 Pyrosequencing results for PCR products

2.3 金银花掺伪量检测

用金银花和山银花的标准品按照1∶1比例进行充分混合，然后提取基因组DNA作为模板，对差异性SNP位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析,结果见图6。混合样品的核酸序列为5’-TT/GGAACCGCT-3’，分型为等位基因频率为“T”和“G”各为50.0%。通过对15份市场销售的含有金银花(或山银花)成分的中成药进行PCR扩增和焦磷酸测序，得到部分中成药成分的焦磷酸测序结果(表4)。中成药中部分中成药焦磷酸测序结果见图7，其中T%代表山银花的含量，G%代表金银花的含量。

图6 金银花掺伪品(50%)扩增产物的测序结果Fig.6 Pyrosequencing results for honeysuckle falsify (50%)

图7 部分中成药焦磷酸测序图Fig.7 Pyrosequencing diagram for TCM

表4 部分中成药焦磷酸测序结果Table 4 Pyrosequencing results of TCM

3 讨论

3.1 焦磷酸测序技术较其他检测方法的优点

我国药用植物种类繁多，基源也比较复杂，基于目前形态学标记的性状鉴定和显微鉴定都难以满足快速、精准的需求，鉴定结果的可靠性较差并且费时费力，理化鉴定主要是以中药中的有效成分为鉴别对象，主要有色谱鉴别和光谱鉴别等[14]方法，虽能辨明中药材的真伪优劣，但对于掺杂现象鉴定效果不佳[15]。依赖于PCR 技术的检测方法主要有随机扩增多态性DNA标记(RAPD)[16]、简单重复序列标记(SSR)、特定序列扩增(SCAR)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)[17-18]、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、扩增片段长度多态性(AFLP)及DNA条形码等[19]，但RFLP、RAPD、AFLP等第一、二代标记技术位点开发难度较大、重复性较差，不易在实践中得到大规模应用[20]。SSR技术开发成本低且多态性、重复性较好，但单个SSR位点的多态性明显不足。本方法的金银花成分掺伪量检测方法是利用焦磷酸测序技术，结合SNP位点标记技术建立的检测方法。该方法兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，而且测序平台一次可检测96个样本，能够与96孔PCR板无缝结合，自动化程度高，操作简单[21]，在遗传分析中，提供核酸序列信息的分子检测技术也是“黄金标准”，而色谱分析法多数情况下须在高温环境下进行，若待分析产物不能被气化，则不能用色谱法进行分析，在应用的范围方面受到一定的限制。

3.2 焦磷酸测序技术可准确读出金银花掺伪量

该方法是以焦磷酸测序技术为基础，对差异性SNP位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析，其中金银花真品的核酸序列为5′-TGGAACCGCT-3′，分型为G/G，山银花的核酸序列为5′-TTGAACCGCT-3′，分型为T/T，在SNP(A/C)位点上分析具有很高的准确性。在测量短DNA链序列方面，是目前唯一能够实时得到定量序列结果的分析技术，兼有PCR技术的灵敏性和焦磷酸测序技术的准确性，具有重复性好、自动化程度较高、操作简单等特点，在3 h之内即可完成金银花成分中掺伪量的检测工作，鉴定结果可以从光信号的峰值直接读出。