六种作物内标准基因开发与检测研究进展

高佳奇,陈硕,王迪,龙艳,李亮*,张晓*

1.长春理工大学生命科学技术学院， 长春 130022； 2.中国农业科学院生物技术研究所， 北京 100081

玉米、大豆、水稻、油菜、棉花和小麦是日常生活中不可缺少的粮食与经济作物，由于转基因作物的上市和推广，其安全性问题受到广泛关注[1-2]。随着来自转基因生物的产品和成分进入食品市场，信息对等和透明度对于消费者接受这些新产品至关重要，这一问题的一个关键因素是能否找到区分转基因食品和传统食品的方法。

在转基因作物及其产品检测方面，内标准基因具有区分不同作物的分子特征。内标准基因是指能够区分物种的特异性、具有单一或恒定的低拷贝数、低变异的保守DNA序列[3]。指定作物种类的内标准基因在转基因成分检测、物种及其产品判别等众多领域内作为鉴别其他物种的遗传标志。种间特异性指的是内标准基因的物种特异性，指定物种与其他物种可通过内标准基因的物种特异性区分出来；种内非特异性指的是在同一物种的不同栽培品种中内标准基因拥有较高的同源性和相似性[4]。在转基因定量检测中，若要计算出样品的转基因含量、获得外源目的基因和样品基因组DNA的质量或拷贝数，则需对内标准基因和外源目的基因进行扩增[4]。样品中植物成分来源的精准判断可通过建立内标准基因的PCR系统进行检测，为后续分析提供基础[5]。内标准基因作为转基因成分的绝对定量检测的关键要素，其扩增效果受引物探针的灵敏度和目标检测物质拷贝数的影响。

对于内标准基因的筛选，首先要对候选基因进行生物信息学分析，其次通过实验进行验证，最后选择合适的具有种间特异性的基因作为内标准基因。一种理想的内标准基因应具有3个特征：物种特异性，基因组中单拷贝数或拷贝数低以及不同品系之间的异质性低[6]。其中，低异质性通常取决于目标DNA序列中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的最小数量以及不同品系之间的高PCR扩增性能[7-8]。混合样品中的转基因作物含量、转基因作物及其产品的源性成分、实验系统的真实性和稳定性均需通过内标准基因来检验[9]。因此，选择可靠的内标准基因对于获得可靠的结果至关重要，理想的内标准基因有望在不同条件(如植物发育阶段和组织类型)下呈现恒定的表达水平，且其表达应不受实验参数的影响。基于此，根据国内外已有的研究成果，本文综述了6种检测或鉴定需求较大的作物(包括玉米、大豆、油菜、棉花、水稻和小麦)的内标准基因的研究进展，并对常见作物的内标准基因进行了系统地比较和研究，以期为植物源性、转基因成分及相关检测鉴定提供技术支撑。

1 植物内标准基因的研究概况

在转基因作物及其产品的定性和定量PCR检测中，内标准基因是不可或缺的关键因素。目前，已开发出多个内标准基因的转基因作物主要有大豆、玉米、油菜、棉花、水稻和小麦。已开发的大豆内标准基因主要有凝集素基因(lectin)[7-11]、β-actin[6]和热休克蛋白(hsp)[12]。其中，大豆中特有的是lectin基因，其最初被用作检测转基因抗草苷膦大豆GTS40-3-2的内标准基因[7,10-14]。在转基因大豆定量检测中，明确被测样品中是否含有大豆来源和鉴定被测样品DNA的质量，均需通过对lectin基因的鉴定。在转基因玉米PCR检测中，玉米醇溶蛋白基因(zein)[11,15-17]、zSSⅡb[10,15,18]、族蛋白基因(high mobility group protein，hmgA)[19-20-22]、玉米转化酶基因(invertase，Ivr)[9,12,21-22]和乙醇脱氢酶基因(alcohol dehydrogenase，adh1)[15]基因都曾被用作内标准基因进行检测；也有研究人员通过对玉米内标准基因zein[11,15-17]、zSSⅡb[8,18,23]、hmgA[19-20,24]、Ivr[9,12,21-22]和adh1[12]的比较，证明其适用于转基因玉米的定性PCR检测[4]。已开发的油菜内标准基因有十字花科素A基因(cruciferin A gene，CruA)[6]、油酰水解酶基因(oleoyl hydrolase gene，FatA)[17]、高迁移率族蛋白基因(highmobilitygroupprotein，HMG-I/Y)[11,19]和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEP)和BnACCg8基因[16,25-26]。基于棉花开发为内标准基因的有磷酸果糖激酶基因(ppi Phosphofructokinase，Cotton-ppi-PPF)[17]、ACP1[3]、硬脂酰ACP去饱和酶基因(stearoyl-ACP desaturase，Sad1)[27-28]、SAH7(SinapisArabidopsishomolog7)[20]和纤维特异性酰基载体蛋白基因(fiber-specific acyl carrier protein，fsACP1)。已开发的水稻内标准基因主要有蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose phosphate synthase，SPS)[29]、RBE4[30]、根部表达基因(rice root-specific gene，gos9)[24,31]、磷脂酶D基因(phospholipase D，PLD)和ppi-PPF[7]。小麦的内标准基因包括乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl-CoA carboxylase，ACC1)[31]、脱落酸诱导蛋白激酶基因(abscisic acid induced protein kinase，PKABA1)[32]、铝诱导的苹果酸转运基因(aluminium-actived malate transporter，ALMT1)[8]、核糖体蛋白L21基因(ribosomal protein L21，RPL21)[8]、颗粒结合淀粉合成酶基因(granule-bound starch synthase，Waxy-D1)[8]、γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)和PSG719基因[21]。

从目前已开发的内标准基因及其扩增片段来看，靶序列具有以下特征：首先，大多数引物设计在外显子区域；其次，在设计内标准基因检测方法时扩增片段一般都较小；最后，用于转基因产品定量检测的内标准基因的拷贝数为恒定的，且多为1个拷贝[33]。值得注意的是，虽然在转基因作物及产品检测中内标准基因是不可或缺的，但被国际实验室循环认证及国际标准化组织认证的内标准基因较少[4]。到目前为止，通过国际实验室循环验证而被国际标准化组织认可的植物内标准基因主要是玉米zein[11,15-17]、zSSⅡb[10,18,23]基因和大豆的lectin[7,10-14]基因。其他基因只被报道或被一些国家的标准化机构所认可和采用。在未来的发展中，转基因检测中内标准基因研究的重点和必然趋势将是被国际循环实验室实验认证和标准化[34]。

2 主要作物内标准基因的研究进展

2.1 玉米内标准基因

玉米是世界三大谷类作物之一，也是重要的粮食作物。由于转基因玉米具有重要的经济价值，其内标准基因的获取成为研究热点。当最常见的玉米内标准基因用作系统校准物时，可通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)获得转基因玉米(ZeamaysL.)的定量结果。特别是，zein、adh1、Ivr1和hmg基因，它们被认为以单拷贝形式存在于玉米基因组中[23]。目前为止，已开发出玉米的内标准基因有zSSⅡb、hmgA、adhl、Ivr1等。表1列出了国内外文献中常见的玉米内标准基因及引物探针序列等信息。Hernandez等[31]在转基因玉米的定量PCR检测和Southern印迹杂交实验中，通过比较玉米的内标准基因Ivr1、10-kDazein、adhl、hmgA筛选出的4对引物均表现出了很好的特异性且有恒定的拷贝数，除10-kDazein为2个拷贝外，其他均为单拷贝。zSSⅡb基因是我国转基因玉米检测标准的内标准基因，而adhl基因是欧盟转基因玉米检测标准的内标准基因。由此可知，一个物种可以开发多个不同的内标准基因，而且同一个基因的不同区域可能都适合作为特异性扩增的序列[3]。

表1 玉米常见内标准基因Table 1 Common reference genes in maize

2.2 油菜内标准基因

耐除草剂的转基因油菜已被允许在美国种植，如耐草甘膦油菜RT73(孟山都)或耐磷化氢油菜MS8xRF3(AgrEvo/PGS)[16]。表2列出了国内外文献中常见的油菜内标准基因及引物探针序列等信息。

表2 油菜常见内标准基因Table 2 Common reference genes in rape

目前已开发的油菜内标准基因有：BnAccg8(X77576)基因、PEP(D13987)基因、CruA(X14555)基因、FatA(AJ294419)基因、HMG-I/Y(AF127919)基因。BnAccg8(X77576)基因作为转基因油菜基因组DNA的定量检测中的内标准基因，其拷贝数为2～3个拷贝，该基因拷贝数的不确定性成为一大难题[16]。PEP(D13987)也被用作油菜的内标准基因，但未明确拷贝数及物种特异性。研究表明，PEP基因被用于转基因油菜的定量与定性检测，发现其有不同扩增的靶序列[26-27]。CruA(X14555)基因被欧盟转基因检测实验室循环认证并采用，可以用于RT73等转基因油菜品种的鉴定，而Hernandez等[31]发现该基因在其他物种中出现了扩增的现象，且CruA基因种间特异性偏低，表明CruA作为油菜标准的内标准基因还有待考证。有研究采用FatA(AJ294419)基因作为转基因油菜RT73鉴定的内标准基因，但BLASTn结果表明FatA基因的引物及扩增片段与芥菜基因的同源性较高，所以FatA的物种特异性满足油菜内标准基因的说法也令人怀疑[19]。此外，Yang等[40]认为HMG-I/Y基因因其特异性好且为单拷贝，适合作为油菜的内标准基因；Weng等[38]对HMG-I/Y(AF127919)基因进行了细致的研究，并对该基因的灵敏度、拷贝数、物种特异性进行了验证，认为该基因符合内标准基因的标准，经比较研究表明，HMG-I/Y(AF127919)能将甘蓝(Brassicaoleracea，CC)、芥菜型油菜(Brassicajuncea，AABB)、甘蓝型油菜(AACC)区分出来。目前已开发的存在着等位基因变化的油菜内标准基因有HMG-I/Y、CruA、PEP，在不同油菜品种中其Ct值波动较大、稳定性较差的基因有BnAccg8、HMG-I/Y，且BnAccg8、HMG-I/Y、CruA、FatA、PEP出现了与拟南芥、萝卜等作物有交叉反应的现象[3]。因此，科学、确切、真实的转基因油菜检测技术迫切需要重新设计引物或开发新的适合的油菜内标准基因[3]。

2.3 水稻内标准基因

水稻是世界三大粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物。随着转基因生物技术的发展，我国转基因水稻的研究处于国际先进水平。表3中列出了国内外文献中常见的水稻内标准基因及引物探针序列等信息。研究表明，通过检验gos9基因的灵敏度、物种特异性、拷贝数、定量系统的稳定性和真实性可知，gos9基因符合水稻内标准基因的要求[31]。经欧盟各实验室转基因水稻定性和定量检验的循环认证，选取了PLD作为水稻的内标准基因[35]。同样通过了国际循环认证的是上海交通大学杨立桃教授团队开发的水稻SPS内标准基因[29,34,40]。通过物种特异性、拷贝数、以及定性定量PCR实验，并建立一系列的检测系统以及开展国际间验证、协同实验等，证明SPS基因符合在转基因检测中水稻内标准基因特征，且SPS定性PCR检测方法的检测下限为0.1%[4,33]。Jeong等[30]通过对RBE基因细致的研究开发了RBE4基因作为水稻的内标准基因。余笑波等[42]通过对gos9、PLD、SPS、RBE4和UBQ5(Ubiquitin5)5种水稻内标准基因进行定量定性检验，筛选出和外源基因PCR产物最为接近的内标准基因为RBE4。对现在已建立的gos9、PLD、SPS、RBE4这4个水稻内标准基因研究中发现，除PLD与高粱、甘蔗、土豆有交叉反应外，其他基因都具有较好的物种特异性，且均无等位基因的变化[42]。所以适用于转基因水稻的检测水稻内标准基因为gos9、SPS、RBE4基因。

表3 水稻常见内标准基因Table 3 Common reference genes in rice

2.4 大豆内标准基因

大豆是人类主要的油料作物和植物性蛋白质来源，而且是重要的工业原料，转基因大豆是目前世界上种植面积最大的转基因作物[8]。表4中列出了国内外文献中常见的大豆内标准基因及引物探针序列等信息。Lectin基因作为转基因大豆(如转基因抗草苷膦大豆GTS40-3-2)定量检测的内标准基因，检测样品来源及鉴定样品DNA质量均需对Lectin基因进行检测[20]。张海波[4]将大豆的品系特异性序列RRS、CaMV35S、NOS序列，和大豆内标准基因序列Lectin分别构建到载体不同的位置，并利用此质粒建立了大豆定量检测的复合PCR系统。Lectin基因被用作大豆的内标准基因是因其具有较高的物种特异性和恒定的拷贝数。而对于大豆的β-actin和hsp基因来说，因其拷贝数和扩增片段不适用于定性检测的深度加工操作，只能作为定性PCR检测中的内部阳性对照。

表4 大豆常见内标准基因Table 4 Common reference genes in soybean

2.5 棉花内标准基因

我国是世界上最大的棉花生产国。表5中列出了国内外文献中棉花常见的内标准基因及引物探针序列等信息。欧盟实验室采用ACP1作为棉花的内标准基因[20]；而Sad1基因被Yang等[34]通过一系列的定性定量PCR检测和Southern杂交实验证明了其种间特异性和种内非特异性以及双拷贝的特点，认为Sad1基因符合棉花的内标准基因标准，可用于内标准基因检测。Baeumler等[20]以widestrike转基因棉花为材料、以SAH7为内标准基因，建立优化定量PCR反应体系，检测出该棉花含量在0.04%～0.05%，从而证实了SAH7适合作为棉花的内标准基因。与上述基因不同的是，研究表明，以玉米、棉花、水稻为材料，以ppi-PPF为内标准基因，可特异性扩增得到长度分别为148、262、79 bp的片段，并得到了定量PCR的验证，提示ppi-PPF基因是玉米、棉花、水稻的共有内标准基因[3]。

表5 棉花常见内标准基因Table 5 Common reference genes in cotton

2.6 小麦内标准基因

对于转基因小麦的检测和定量，先前已经报道了4种不同的内源参考基因ACC1、PKABA1、ALMT1和Waxy-D1，以及相应的实时PCR分析[21-24]。ACC1基因及其实时PCR检测不仅适用于普通小麦，还适用于硬粒小麦的定量，其PCR性能在以18个普通小麦和10个硬粒小麦为模板的反应中得到了验证[22]。PKABA1实时PCR测定法对小麦和大麦具有特异性，因此开发了一种采用1组引物和2个TaqMan探针的双链实时PCR测定法，用于定量小麦和大麦。但是，很难开发出一种适用于高特异性转基因小麦分析的合适的PKABA1分析方法[45]。ALMT1实时PCR检测对普通小麦具有高度特异性，可在15个品系中提供稳定的PCR性能[15]。Waxy-D1实时荧光定量PCR检测方法对普通小麦也具有高度特异性，在19个普通小麦品种中产生了相似的PCR性能[23]。

由于小麦品种(L属)中复杂的基因型和核型，选择合适的内标准基因进行转基因小麦分析仍然存在困难[31]。根据定性PCR扩增结果，不仅在所有六倍体普通小麦品系中观察到ACC1基因和PKABA1基因的扩增子，而且在AegilopsspeltoidesTausch.(BB)、TriticumurartuL.(AA)和硬粒小麦(BBAA)中均观察到了这一现象。ACC1和PKABA1分析对普通小麦的特异性较低。ALMT1和Waxy-D1基因扩增子无法从AegilopsspeltoidesTausch.(BB)、小麦TriartumurartuL.(AA)和硬质小麦(BBAA)中扩增，表明这2个基因更适合鉴定普通小麦品种。结果还表明，ACC1基因来自B基因组，PKABA1来自A基因组，Waxy-D1和ALMT1基因来自小麦D基因组。因此，不可能利用来自单倍体A、B和D基因组的任何基因从普通小麦品系中特异性鉴定中国八倍体小黑麦。这些结果表明，在为任何给定物种选择新的内源参考基因时，应考虑基因型和核型情况[31-32]。

目前，依据文献，小麦的内标准基因共有7种，分别为乙酰胆碱羧基酶基因(acetyl-CoA carboxylase，ACC1)[31]、脱落酸激酶基因(abscisic acid induced protein kinase，PKABA1)[32]、铝激活苹果酸转运蛋白基因(aluminium-actived malate transporter，ALMT1)[8]、核糖体蛋白L21基因(ribosomal protein L21，RPL21)[8]、颗粒结合淀粉合成酶基因(granule-bound starch synthase，Waxy-D1)[8]、γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)[8]和PSG719基因。表6中列出了国内外文献中小麦常见的内标准基因及引物探针序列等信息。黄华丽[5]评估了ACC1基因、PKABA1基因、ALMT1基因和Waxy-D1这4种小麦内标准基因的实时定量PCR中的可靠性和稳定性，对这4种内标准基因定量扩增靶标区分别进行测序，结合测序结果发现存在的SNP位点很大程度上影响了一些小麦品系基因组的定量检测序结果和定量统计分析，最终得出Waxy-D1基因在小麦定量分析中适性更强些。刘易科等[48]筛选到小麦PSG719基因具有特异性强、拷贝数低等特性，并具有普通小麦的特异性和品种间的稳定性，经定性、定量PCR极限检测，结果表明该基因PCR反应的灵敏度较高，可以对小麦转基因成分含量较低的样品进行检测和定量；以经梯度稀释的小麦基因组DNA为模板，定量PCR标准曲线斜率-3.395，相关系数R2为0.999。上述结果表明，普通小麦内标准基因PSG719是一个理想的内标准基因，可以用于转基因小麦的定性和定量检测[47-48]。

表6 小麦常见内标准基因Table 6 Common reference genes in wheat

3 展望

内标准基因在植物分子生物学与分析测试中应用十分广泛。如今，大多数转基因作物均已开发相应的内标准基因，有的还有多个适用的内标准基因。分子生物技术的广泛应用也随之带来一系列的安全问题，面对这些问题，植物产品的监管与检测就需要使用内标准基因。转基因作物及其产品的检测以及作物成分的鉴定都需要以内标准基因为基准，所以内标准基因有着极大的开发应用价值。但就目前而言，内标准基因的开发也有许多不足之处，如就物种特异性要求而言，已开发出的内标准基因的物种特异性不强。对于定量PCR或者数字PCR检测，检测结果的真实性及有效性对内标准基因有着极大的要求。时至今日，较多的内标准基因的特异性和拷贝数没有经过标准的检验，导致应用混乱。对于内标准基因的标准各国之间也存在很多不同之处，因此，我国有必要对各物种的内标准基因进行比较，筛选出最符合的内标准基因要求的基因并进行循环验证。近些年来，各主要转基因物种均发布了若干内标准基因，但实践表明，不同内标准基因所获定量结果差异较大，如何选择内标准基因成为重点和难点。后续可以通过查找玉米、大豆、油菜、棉花、水稻和小麦等主要作物的内标准基因并创建数据库、优化实验方法找出最佳的内标准基因。