HPV核酸检测标准物质研究进展

杨佳怡,陈桂芳,高运华,王志栋,吴枭

1.中国计量科学研究院， 北京 100029 2.沈阳化工大学化学工程学院， 沈阳 110142

2008年，德国癌症研究中心的科学家Harald zur Hausen因发现人乳头状瘤病毒(HPV)导致宫颈癌而获得诺贝尔生理学或医学奖。基于他的研究工作，HPV获得性预防疫苗快速发展，显著降低了女性罹患宫颈癌的风险[1]。与此同时，HPV的检测在宫颈癌的筛查和诊断过程中发挥着重要的作用。在了解HPV基因功能与作用机制的基础上，研究者研发了多种针对HPV核酸的检测方法，进而形成了商品化的检测试剂盒。在基于PCR扩增的HPV DNA检测试剂盒中，多数将编码衣壳蛋白L1的基因作为检测的目标区域，少数针对E1、E2基因或多种不同基因同时进行检测[2-3]。随着对癌变发生机制的深入研究，E6/E7 mRNA水平受到广泛的关注，也是HPV RNA检测的主要内容[4]。值得注意的是，HPV核酸检测过程存在一些影响因素，例如病毒裂解与DNA提取和纯化效率、引物探针的通用性等；对于荧光定量PCR过程，标准曲线的准确性将直接影响测量结果。上述多种影响因素可能导致检测结果缺乏可比性，从而误导对病情的判断，不利于及时干预治疗。具有确定量值的标准物质可以对不同的检测试剂盒进行计量校准，提升检测的准确性。本文讨论了用于HPV核酸检测过程的标准物质研究进展，分析了不同形式的标准物质候选物的特性，为进一步提升HPV检测结果的准确性提供了参考。

1 高危型HPV常见检测方法

人乳头状瘤病毒(HPV)是一种无包膜的双链闭环DNA病毒，其基因组包括3个功能区：非编码上游调控区(URR)、早期转录基因(E1、E2、E4、E5、E6和E7)、晚期转录基因(L1和L2)[5]。早期蛋白与病毒的细胞转化功能及致癌作用关系密切[6]；L1和L2是HPV的主要和次要衣壳蛋白，共同形成病毒的衣壳，参与HPV感染细胞的过程。L1具有自组装的功能，L2不能单独自组装但可以与L1共同组装成病毒颗粒[7]。按照感染引起疾病的严重程度，HPV可以分为低危型(HPV6、11、40、42等)和高危型(HPV16、18、52、58等)，高危型HPV感染与宫颈癌的发生具有密切关联[8]。已有研究证明，高危型HPV16、18中的E6蛋白能与细胞中的p53蛋白结合并导致p53蛋白的降解，从而破坏p53抑制肿瘤发生的作用[9]；E7蛋白则导致另一种抑制肿瘤发生的Rb蛋白降解[10]，E6、E7可以导致两种重要的肿瘤抑制蛋白发生降解，解释了宫颈癌形成的重要机制。大部分的HPV感染可以被人体清除，只有高危型HPV的持续感染才会导致癌症的发生[11]。宫颈癌早期没有明显的临床症状，因此针对HPV的检测对于相关疾病的及时筛查与治疗具有重要意义。

基于PCR扩增技术对HPV核酸进行分析是HPV检测最常见的方法。对HPV DNA进行检测可以诊断HPV的感染，并分析发生感染的HPV分型。现有的HPV DNA检测方法，主要针对L1基因的保守性区域设计PCR引物[12-13]，PCR扩增完成后，可以利用反向杂交法对HPV进行分型分析[14]。一些检测试剂盒基于荧光定量PCR技术，通过特异性的荧光探针，可以实现对特定亚型HPV的半定量检测[15-16]。在荧光定量PCR反应中，对多重荧光信号分别检测，可以同时实现HPV的分型与定量检测，提高了检测的效率[17]。HPV致病机制的研究揭示E6/E7 mRNA含量与病变过程密切相关[18]，因此E6/E7 mRNA的检测也受到了越来越多的关注，已有研究者开发了针对E6/E7 mRNA的检测试剂盒：利用逆转录酶和RNA聚合酶对RNA扩增，结合荧光标记的DNA探针进行检测[3]。在分析比较HPV DNA和RNA检测结果参考意义的探讨中，有研究者提出，在HPV DNA检测结果为阴性的情况下，判断健康的参考性更好，而在HPV RNA阳性的情况下，判断患病的参考性更好[19]。对于发生癌前病变的细胞(CIN3+)，两种检测方法均表现出较好的灵敏性，且具有较高的符合率[20]。

2 HPV核酸检测过程的影响因素

对于基于PCR扩增的检测方法，需要在反应前对样品中的核酸进行提取，在针对人类巨细胞病毒DNA的定量检测中，研究者证明了DNA提取过程的效率直接影响后续的测量结果[21]；在本团队前期工作中，观察到不同逆转录试剂盒导致猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA检测结果表现出显著差异[22]，提示为了全面理解核酸检测结果，应充分考虑DNA提取或RNA逆转录过程的影响。在检测HPV核酸的过程中，不同试剂盒提取DNA或逆转录RNA采用的试剂和方法不同，可能会对检测结果造成影响。与此同时，对于使用通用型引物进行检测的试剂盒，引物与不同亚型的HPV基因扩增区域的结合能力有所区别，在检测HPV混合性感染的样品时，可能会导致部分漏检[23]。不同试剂盒引物和探针设计方法存在差异，其差异可能造成检出限不同，从而导致检测样品的有效范围不同[13,24]。在以上影响因素之外，不同检测实验室中定量PCR仪等相关仪器的运行状态、实验人员操作的规范程度都可能影响检测结果。在缺乏计量标准的情况下，不同检测试剂盒测量的结果难以做到完全一致可比，可能影响判断的准确性并导致重复检测造成的浪费。

荧光定量PCR的基本原理是测量PCR扩增过程中积累的荧光信号，在进行定量检测的过程中依赖于标准曲线[25]。一般采用已知量值的工作标准物质绘制标准曲线，工作标准物质的量值准确性和溯源性是保证检测结果可信度的关键，根据GB/T 21415—2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》规定：为某一校准品或正确度控制品的一个指定值所赋的值的测量正确度取决于该值通过不同测量程序和测量标准(校准品)的不间断比较链而具有计量学溯源性，比较链逐级向上,测量不确定度不断减小。然而我国目前尚无针对核酸检测试剂盒溯源性的明确技术要求[26]，这样的情况也将导致不同的检测试剂盒定量检测的结果存在差异。

3 HPV标准物质与参考品的研究

为了提高HPV检测结果的准确性和一致性，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)在2008年针对两种高危型HPV16和HPV18，构建了包含全基因组序列的重组质粒，作为核酸标准物质对来自13个国家不同实验室的定性和定量检测结果进行了比对[27]。随后，利用类似的方法，WHO还研制了包含2种低危型(HPV6、11)和5种高危型(HPV31、33、45、52、58)的核酸标准物质[28]。然而国际标准物质不易购买，很难满足国内计量校准的巨大需求。国内的研究者相继研制了包含HPV L1基因序列和全基因组基因序列的重组质粒DNA标准物质和质控品，涵盖了常见的低危和高危HPV亚型，为HPV DNA分型与检测过程提供了参考[29-31]。常见的检测参考品形式还包括灭活的临床样品、细胞系以及假病毒等，下文将进行详细的介绍。

3.1 重组质粒DNA标准物质和参考品

在世界卫生组织的组织和管理下，英国国家生物标准品和参考品研究所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)于2008年建立了第一个包含全基因组序列的HPV16(1×107IU·mL-1；International Unit, IU)和HPV18(1×107IU·mL-1)国际标准物质。其定值方法是通过分光光度法测定量值后，对标准物质直接赋值：在260 nm处测定标准物质原液的吸光度值并根据质粒分子量计算其浓度(genome equivalents·mL-1, GE·mL-1)，按一定比例稀释到1×107GE·mL-1，分装0.5 mL·瓶-1，冻干后赋值为5×106IU·瓶-1[27]。在此基础上，NIBSC补充建立了7种HPV基因型的标准物质。定值时以已有标准物质为参照，使用实时荧光定量PCR建立标准曲线，并在不同实验室对多种检测试剂方法进行了评估比较[28]。

我国卫生部临床检验中心参考国际标准物质研制方法，建立了以人基因组DNA为基质的HPV16、18全基因组重组质粒DNA标准物质。使用4种实时荧光PCR试剂联合测试，通过国际标准物质建立标准曲线完成定值，并计算不确定度，HPV16标准物质量值为(7.1±1.0)×106IU·mL-1，HPV18标准物质量值为(3.5±0.7)×106IU·mL-1；上海市临床检验中心、广州邦德盛生物科技有限公司等单位也分别研制了HPV16和HPV18全基因组重组质粒DNA的国家有证标准物质。这些标准物质具有确定量值和不确定度,量值均可溯源至国际标准物质HPV16或HPV18，表1中列举了我国现有的可查询的HPV核酸检测的有证标准物质。

表1 HPV核酸检测有证标准物质Table 1 List of certified reference materials for HPV nucleic acid detection

卫生部临床检验中心制备了7种常见HPV基因型(HPV6、11、31、33、39、51、52)的全基因组重组质粒DNA参考品并进行了定值：采用分光光度法测定重组质粒在260 nm处的吸光度值，根据质粒分子量计算得到GE·mL-1浓度值，用含人基因组DNA的BSA溶液梯度稀释至106GE·mL-1和105GE·mL-1[29]；中国药品生物制品检定所建立的包含L1基因的重组质粒DNA参考品，涵盖常见的30种HPV基因型[30]；中国食品药品检定研究院建立了包含20种HPV基因型的全基因组重组质粒DNA参考品，经1 mg·mL-1人基因组溶液稀释至106copies·mL-1[31]；长春理工大学也建立了涵盖14种中高危型和6种低危型的HPV全基因组重组质粒DNA参考品；将不同基因型参考品测定浓度值后统一调为50 pg·mL-1(108～109copies·mL-1)[32]；利用HPV DNA分型参考品，可以对相关试剂盒和实验室的HPV分型检测过程进行质量评估。

3.2 阳性临床样品参考品

临床检测实验室的研究人员曾报道采用临床样品制备参考品进行室内质量控制：获取低危型(HPV6/HPV11)和高危型(HPV16/HPV18)的临床样品，经灭活、稀释后配制室内参考品，用于HPV检测的室内质量控制[33]。宫颈癌细胞系也被用作质控参考品，上海市临床检验中心采用整合有L1基因的人宫颈癌细胞系(SiHa和HeLa)作为HPV16和HPV18检测参考品，用实时荧光PCR试剂盒检测，通过国际标准物质建立标准曲线计算定值为106IU·mL-1，梯度稀释为不同浓度的参考品[34]。卫生部临床检验中心建立了HPV16/HPV18双阳性的参考品：将载有HPV16基因的重组质粒转染已包含HPV18的人宫颈癌细胞系(HeLa)，灭活后获得同时含HPV16/HPV18基因组DNA的参考品，通过荧光定量PCR进行检测[35]。与质粒DNA相比，灭活后的临床样品更加接近临床样品的状态，可以为临床实验室间的质量评估提供参考。

3.3 假病毒形式的参考品

近年来，假病毒技术的不断发展为HPV标准物质和参考品的研制提供了新的工具，假病毒可以携带外源病毒的特定基因片段，因为不包含外源病毒的完整基因，假病毒只能对细胞进行“一次性”感染，在研究致病性病毒的过程中具有较好的安全性[36]；假病毒颗粒具有衣壳蛋白包裹核酸的完整结构，更接近真实病毒样品的状态，可以对病毒颗粒裂解、核酸提取纯化以及PCR扩增与检测的全过程进行质量控制。在衣壳蛋白的保护下，假病毒可以更好的抵抗核酸酶降解，利于在运输和储存过程中保持其稳定性。针对高危型HPV的衣壳蛋白编码基因(L1、L2)，研究者制备了同时包含荧光蛋白报告基因的假病毒颗粒，并将其应用于血清中的免疫原性检测[37-38]。在癌症发病进程的诊断中，HPV E6/E7 mRNA水平逐渐受到更多的关注，利用大肠杆菌表达体系，研究者制备了包含E6/E7 RNA的假病毒质控品，并通过反转录-荧光定量PCR的方法进行了定值，为HPV E6/E7 mRNA检测试剂的应用提供了参考[39]。表2总结了WHO研制的和国内常见的用于HPV核酸检测的标准物质和参考品。

表2 常见用于HPV核酸检测的标准物质和参考品Table 2 List of reference materials for HPV nucleic acid detection

3.4 分析比较

HPV质粒DNA标准物质和参考品的应用过程中，虽然通过加入人类基因组DNA，可以一定程度上模拟检测过程中的基质效应，但质粒DNA作为质控时，其应用范围仅限于DNA扩增和检测环节，很难对病毒颗粒裂解、DNA提取与纯化等步骤的效率进行考察[27]。虽然现阶段HPV核酸标准物质还是以质粒DNA的形式为主，但其明显的局限性也提示了研制不同形式标准物质的重要性。临床样品作为参考品存在的问题是来源不够稳定，细胞系建立与培养的过程较为复杂。而假病毒不仅包含检测目标基因同时具有衣壳蛋白结构、操作安全、存储稳定，可以作为未来HPV核酸标准物质重点关注和研究的方向。

4 展望

标准物质是指足够均匀且具有确定的特征，用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。标准物质具有复现、保存和传递量值的作用，是保证测量结果准确性与可溯源性的重要计量“器具”，为了进一步提升HPV核酸检测的有效性，标准物质的研制工作必不可少。质粒DNA形式的标准物质无法对DNA提取纯化等过程进行质控，应用范围有所限制。假病毒具有安全稳定、包含完整病毒结构的优势，适用于相关试剂盒的整体检测过程，可以作为核酸标准物质的候选物质。HPV致病机制的前期研究，揭示了不同基因的调控作用和编码蛋白的生物学功能，为检测目标的选择提供了基础。结合假病毒技术开展HPV标准物质的研究工作，有助于提升HPV检测的有效性，从而促进女性宫颈癌的准确诊断和及时治疗，改善患者的生存质量。与此同时，标准物质也将帮助解决众多检测试剂盒量值溯源混乱的问题，为实现量值准确可比提供计量支撑。