药物眼毒性非临床安全性评价的关注要点

邵 雪，刘 斌，岑小波，王庆利，黄芳华

（1.国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022；2.国家成都新药安全性评价中心，四川 成都 610041）

药物眼毒性作为一种特殊的药物毒性，可明显影响患者的生活质量，甚至带来严重后果。因此，在新药研发过程中需对眼毒性予以特别关注。对于药物研发来说，在药物的早期开发阶段，应在全面的非临床安全性评价的基础上重视潜在的眼毒性反应，从作用靶点、机制通路和组织分布等方面进行优化，以获得眼毒性风险最小的药物，并通过非临床研究对临床使用的获益/风险比进行评价，这对于后续临床试验甚至产品上市后的应用至关重要。

在毒理学试验中，眼毒性的检查方式包括眼科检查和眼组织病理学检查，但针对常规检查中发现的眼毒性如何展开深入研究是一项挑战性的工作。目前，国际人用药品注册技术要求协调会（International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）和欧盟药品管理局（European Medicines Agency，EMA）均无眼毒性非临床安全性评价的相关指导原则。经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）环境局（Environment Directorate）于2019年7月25日发布《第263号指导原则：关于严重眼损伤和眼刺激试验及评价的测试和评估综合方法（Integrated Approaches to Testing and Assessment，IATA）》［1］，其中包含OECD对于评估严重眼损伤和眼刺激的5个体外试验及1个采用白化兔开展的体内试验《试验405：急性眼刺激/腐蚀试验方法》［2］的方法和建议，未涉及药物眼毒性的非临床安全性评价的策略或具体要求。

本文在调研已上市药物在非临床研究、临床研究及上市后眼毒性的基础上，通过介绍代表性案例中针对眼毒性发现的非临床研究策略，分析和探讨可能引起眼毒性药物的非临床安全性评价的关注要点，供新药研发者参考和借鉴。

1 代表性案例中眼毒性发现的非临床研究策略

调研发现，已上市药物中精神和神经系统类药物及多种抗肿瘤药物眼科不良反应比较常见。与全身用药相比，眼科药物由于给药方式的特殊性，其非临床研究会涉及较为全面的眼科检查和眼组织病理学检查，更容易在临床试验开始前获得较为全面的眼毒性信息。而对于全身给药的产品，其眼毒性风险通常需结合作用靶点、作用机制以及同类产品的非临床和临床数据进行预估。例如，许多精神和神经系统类药物具有眼毒性风险，在其较长周期的重复给药毒性试验和（或）致癌性试验中可常见眼毒性反应。例如，①已上市25年的抗癫痫药托吡酯（topiramate，商品名Topamax®）在大鼠试验中可见视网膜萎缩，临床应用过程中出现视力模糊、复视、视觉障碍和视野缺损等可能因视网膜病变引起的眼部不良反应。②用于治疗精神分裂症的非典型抗精神疾病药阿立哌唑（aripiprazole，商品名Abilify®），在大鼠26周重复给药毒性试验和大鼠2年致癌性试验中，在药物暴露量约为人最大推荐剂量下暴露量的7～14倍时导致视网膜变性，在白化小鼠和猴的视网膜评估中未见视网膜变性，未进行进一步研究其发生机制的追加试验，其导致视网膜变性的机制不明，大鼠表现出的视网膜变性与人类风险的相关性不明。在临床试验中可见视力模糊，并可见畏光（发生率为少见）和复视（发生率为罕见）［3］。③ 2014年首次获得批准的苏沃雷生（suvorexant，商品名Belsomra®）为首个用于失眠的食欲素受体拮抗剂，在大鼠2年致癌性试验中，视网膜萎缩的发生率增加。在该试验中，最低剂量下大鼠的血浆暴露量约为人最大推荐剂量下暴露量的7倍；在大鼠6个月试验中未见视网膜萎缩；在随后追加进行的白化SD大鼠和有色Long-Evans（LE）大鼠慢性毒性试验（12和18个月）中，在给药更长时间后（SD大鼠给药9或12个月后，LE大鼠给药12个月后）可引起视网膜萎缩发生率升高，但与白化大鼠比，有色大鼠视网膜萎缩的发生时间较晚，发生率较低，提示眼色素沉着可减缓视网膜萎缩的发生；苏沃雷生在人体中未见明确的眼部不良反应［4-5］。

值得注意的是，用于治疗帕金森病（Parkinson disease，PD）的药物沙芬酰胺（safinamide）在毒理学试验中，大鼠和小鼠均检出视网膜变性，为此研究者对其眼毒性进行了深入的非临床研究，且在临床试验期间根据非临床研究提示的眼毒性风险，对受试者进行详细的眼科检查并制订专门的眼科风险控制计划。同时，结合临床试验中出现的眼部不良反应特征深入探索眼毒性机制，综合非临床和临床试验获得的数据进行全面评价。该品种在毒理学试验中发现眼毒性信号后，追加进行了一系列研究，其针对眼毒性的非临床研究策略具有较大的参考价值。故以此为代表性案例［6-8］，分析和探讨针对眼毒性发现的非临床研究策略。

1.1 沙芬酰胺眼毒性

沙芬酰胺是由Newron制药公司和Zambon公司共同研制的治疗PD的药物，2017年3月21日获美国FDA批准上市，是美国在十多年来首个获准用于治疗PD的新化合物，批准的适应证为“用于左旋多巴/卡比多巴治疗的PD患者出现‘关期’症状的辅助治疗”。该品种在毒理学试验中发现眼毒性，并在临床试验过程中曾因毒理学试验结果而被美国FDA暂停临床，并被要求追加研究。在该品种申请上市注册时，研究者在毒理学部分专门撰写了“临床前研究中的视网膜毒性概述”，总结了一般毒理学试验和致癌性试验中的视网膜变化，主要内容概括：①大鼠13和26周的重复给药毒性试验中可见视网膜变性，但4周重复给药毒性试验中未发现，最低病变剂量是每天15 mg·kg-1。大鼠初始视网膜变性的组织病理表征为外核层（outer nuclear layer，ONL）中弥散性核损失，在更长给药周期的毒性试验中变性进展至ONL几乎消失的阶段，且出现色素上皮细胞和内核层（inter nuclear layer，INL）改变。②猴重复给药毒性试验（4，13和39周）均未见视网膜变性。③基于重复给药毒性试验的发现，在致癌性试验中重点关注了眼毒性。在大鼠13周致癌性预试验中，所有剂量组均出现视网膜病变。在大鼠2年致癌性试验中，所有剂量组均出现视网膜变性和白内障。在小鼠2年致癌性试验中，观察到与药物相关的视网膜变性。④本品临床应用为左旋多巴/卡比多巴的辅助用药，研究者进行了与PD治疗相关药物的联合用药研究，包括沙芬酰胺与左旋多巴/卡比多巴联合用药以及沙芬酰胺与普拉克索联合用药的大鼠和猴重复给药毒性试验。在LE有色大鼠和白化SD大鼠中开展的联合用药试验中均检出视网膜变性，与左旋多巴/卡比多巴联合用药时变性未见严重，但与普拉克索联合用药时影响更严重。电镜检查结果显示，沙芬酰胺单药或与普拉克索联合用药后，SD大鼠可见光感受器和ONL改变；沙芬酰胺与普拉克索联用，LE大鼠可见视网膜光感受器的外节膜盘处碎裂、排列紊乱，以及视网膜光感受器的内节处变性和个别细胞坏死（光镜下表现轻度的光感受器层及外核层萎缩），且SD大鼠的视网膜损伤程度更为严重。在猴联合用药毒性试验中未见视网膜变性。

1.2 沙芬酰胺眼毒性的可能机制

针对以上发现，研究者还开展了一系列关于该产品引起大鼠视网膜变性的可能病理机制的研究。①对白化大鼠视网膜中多巴胺和多巴胺代谢产物浓度进行研究：沙芬酰胺的主要靶点是B型单胺氧化酶，视网膜中多巴胺的更新低于其他脑部区域，可能导致过量的细胞外多巴胺对神经元细胞产生影响。结果显示，沙芬酰胺未对大鼠视网膜中的多巴胺代谢产生相关的生物学效应。②评估了沙芬酰胺对有色大鼠视网膜电图（electroretinogram，ERG）参数的影响及其与频域光学相干断层扫描（spectral domain-optical coherence tomography，SD-OCT）、组织学和电子显微镜检查的相关性：不同检测方法的结果可相互印证，其中视网膜厚度的不可逆性下降主要归因于ONL萎缩或（和）变薄。此外，还进行了时程、大鼠品系及环境光照对视网膜毒性影响的研究。结果显示，视网膜毒性的严重程度呈时间依赖性增加；在早期时间点对有色大鼠的影响比白化大鼠更明显，但长期给药后2种品系大鼠的视网膜核ONL细胞数减少，与光感受器区变薄基本相似；视网膜变化的出现、严重程度和发生率与沙芬酰胺剂量和光照强度相关。

1.3 相关因素的分析

研究者还进行了视网膜与其他因素之间的相关性分析，主要结论如下：①与光毒性的关系。沙芬酰胺及其主要代谢产物在紫外290～700 nm范围内不存在任何吸收，认为不需要开展光毒性研究，光毒性可能不是视网膜病变的原因。②与黑色素结合的关系。虽然在有色大鼠的眼睛以及其他有色组织中，发现14C-沙芬酰胺可与黑色素结合，但是白色大鼠和有色大鼠均出现视网膜变性，因此认为与黑色素结合无关。③与视网膜中药物浓度的关系。研究了14C-沙芬酰胺和代谢产物在有色大鼠和白化大鼠中的分布，特别是眼分布，研究认为大鼠体内主要代谢产物NW-1689很可能与视网膜毒性不相关。

在以上研究中，除眼毒性的常规检查方法（眼科检查和组织病理学检查）外，研究者还采用多种方法或技术进行了眼毒性研究，包括ERG、SD-OCT和电子显微镜，以研究视网膜损伤的性质和部位。通过上述一系列试验，视网膜病变的性质基本清楚，但其发病机制尚未阐明。

1.4 临床试验眼毒性监测

基于非临床研究发现，在沙芬酰胺的临床试验中对眼部安全性进行了监测。监测包括视觉功能评估，包括约2000例患者的视敏度、色觉、视野和眼底检查，其中1000例患者进行了长达2年的观察。此外，还在一些试验中进行了裂隙灯检查、眼内压测定和眼外观检查，约400例患者获得OCT数据，20例患者获得ERG数据［6］。基于试验结果，研究者认为，沙芬酰胺在人体内不产生视网膜毒性。综合以上非临床和临床研究结果，研究者认为，沙芬酰胺诱导的视网膜萎缩是一种啮齿类动物特异性现象，临床患者中视网膜变性的风险未升高。

综上，研究者围绕非临床试验中出现的视网膜病变进行了深入研究，并认为该病变是啮齿类动物特异性改变。但美国FDA审评认为，研究者提出该病变为啮齿类动物特异性改变的依据主要是人和猴未发现视网膜病变，仅在大鼠中发现，但研究者并未提供其为啮齿类特异性改变的眼毒性机制基础；而且，尽管研究者说明在人体中未见视网膜异常，但临床专家审评认为研究者所采用的方法不足以检测药物引起的变化，临床数据太有限而不能得出在人体中不导致视网膜变性的结论［6-7］。此外，在临床试验中发现眼器官疾病的不良反应，包括白内障为常见不良反应，视网膜疾病为不常见不良反应。因此，最终认为该视网膜病变应认为可能与人体相关。在美国FDA批准的说明书［8］中，在“非临床毒理学”项下写入了大鼠视网膜病变的数据，并指出“研究未能确定沙芬酰胺视网膜毒性的潜在机制，与人的相关性不明确”，还在“警告和注意事项”项下列出了大鼠视网膜病变数据，并对视网膜病变/眼科疾病的特殊人群做出风险提示，要求定期监测视力变化。

2 眼毒性非临床安全性评价关注要点

在上述代表性案例中，在常规毒理学试验发现眼毒性的情况下，为了阐述其眼毒性风险，必要时进行追加的眼毒性非临床安全性评价，并采用不同的试验设计和多种眼科检查方式对眼毒性进行检测。基于对已上市药物的非临床和临床资料的调研，以及当前眼毒性安全性评价的可行方法和试验特殊性，提出以下在非临床研究阶段进行眼毒性安全性评价的关注要点。

2.1 动物种属选择

通常情况下，根据药物的作用靶点、作用机制及适应证特点综合考虑非临床研究中的相关动物种属。

对于眼科药物，考察眼表局部刺激性时，可选用兔作为实验动物；眼内注射药物通常选择猴作为合适的动物种属，因为猴眼与人眼的结构最为相似，且只有灵长类动物才具有黄斑结构。动物的年龄、数量和性别要求与其他药物相似，无特殊要求。以阿柏西普（aflibercept）为例，猴作为相关动物种属用于其非临床安全性评价、药代和药效学研究。根据美国FDA审评意见，人和猴的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）序列相同且二者眼底结构类似；尽管阿柏西普能与大鼠、小鼠和家兔的VEGF结合，但啮齿类动物和家兔的眼球结构与人存在较大差异，且重复给药后存在较高的免疫原性。因此，选择食蟹猴为实验动物进行非临床研究［9］。

2.2 给药频率

对于可能存在潜在眼毒性风险的药物，其重复给药毒性试验的给药期限、给药频率与常规药物一致，根据拟定的临床给药期限及开发阶段设计相应的给药期限，给药频率一般与临床用药频率相同。对于临床用药间隔较长的药物（如2～3个月或更长），在安全性评价时可考虑适当缩短给药间隔，增加给药频率，以尽量暴露毒性风险。

2.3 给药剂量

全身给药所致的药物相关眼毒性反应一般具有时间依赖性和剂量依赖性，如长期给高剂量的表皮生长因子受体激酶抑制剂（≥6个月）可能引起角膜水肿混浊。在获得动物体内的毒性信息后，通常将毒性剂量进行种属间体表面积换算以估算拟用人体剂量的安全范围。

对于眼科药物，剂量设计通常可不考虑种属体表面积差异的因素，可直接参考临床剂量，但需同时考虑不同种属动物眼球或玻璃体体积的差异。美国FDA认为猴和人的玻璃体分别为2和4 mL［7］；澳大利亚药物管理局（Therapeutic Goods Administration，TGA）和EMA则认为是1.5和4.5 mL［10-11］。对于眼部用药，尤其是眼内给药，受限于药物浓度和可给药体积的限制，剂量设置的跨度范围通常有限，高剂量可能仅达到临床剂量的数倍。如阿柏西普在食蟹猴重复给药毒性试验中未见不良反应剂量（no observed adverse effect level，NOAEL）为每眼4.0 mg，而阿柏西普对不同适应证的临床使用剂量为每眼2.0 mg（每眼50 μL），1个月注射1次。虽然该NOAEL剂量下眼球局部暴露水平仅约为人体的6倍，欧洲人用医药产品委员会（Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP）认可上述安全系数，其主要原因为考虑到受试物的处方组成、眼部给药体积和给药频率不能继续增加等因素的限制。在雷尼珠单抗（ranibizumab）的玻璃体注射重复给药毒性试验中，可见剂量相关的眼前段和眼后段炎症反应。考虑到猴和人的玻璃体体积、给药剂量（猴每眼0.5 mg，人每眼0.3 mg）和给药频率（猴每2周1次，人每4周1次）之间的差异，美国FDA认为0.5 mg剂量下出现的前房炎症和玻璃体炎症细胞发生率和严重程度均远低于更高剂量下的水平，认可该剂量作为NOAEL以支持人体应用［12］。

2.4 眼毒性的检测手段和判断标准

常规眼科检查包括肉眼和（或）借助瞳孔笔灯等观察眼局部反应（有无结膜充血、水肿、分泌物增多、角膜混浊、瞳孔及其对光反射等），采用裂隙灯显微镜（眼前节检查）、裂隙灯间接眼底镜或直接检眼镜或双目间接检眼镜（眼底检查）检查结膜、角膜、前房、虹膜、晶状体、玻璃体、黄斑、视乳头、视网膜及视网膜血管等结构。对于眼科制剂，可能还需测定给药前和给药后的眼压以进行对比，并应注意区分由于腔内注射药液引起的短暂的物理性眼压升高和药物导致的眼压升高。以阿柏西普为例，玻璃体内注射，60 min内会发生眼内压急剧升高的状况。在玻璃体内重复给予VEGF抑制剂时，也会出现眼压持续升高的情况。因此，应及时监测眼内压和关注视乳头血流倒灌等现象，并进行适当的处理，因为长时间高眼压可能导致视网膜血管阻塞、视网膜神经节细胞不可逆性损伤等。

除常规眼科检查外，可根据药物特点增加特殊的眼科检查，如荧光造影、OCT和眼电生理检查，进一步获知眼部较为细微的结构变化或功能的改变，以及考虑开展眼组织的免疫组化分析等。

OCT主要用于视网膜、脉络膜各层结构的扫描检查，可发现组织形态、反射性等变化，提示水肿、炎症、脱离和纤维化等病变。荧光造影检查是通过荧光强弱改变提示眼底血管的相关病变，主要用于发现眼底血管渗漏、新生血管、眼底出血和眼底血管阻塞等病变。眼电生理检查可记录在光或图形刺激下视网膜的电位变化，通过观察和判断药物对视网膜的毒性反应，确定视网膜血管性、炎症性和外伤性因素等造成的功能损害。此外，使用上述眼科仪器检查时，均应注意保护眼睛，预防角膜干燥和眼部感染。当眼部给药出现较强的免疫原性反应时，应注意检查其余相关组织的免疫毒性。表1列出了对于眼毒性的关注点和相应检测手段，该表不代表必需要求，仅用作试验参考。此外，在具体试验中还需结合眼毒性体征的严重程度及其可逆性、是否具有剂量相关性等进行综合判断。

表1 眼毒性关注点和检测手段

2.5 检测时间和频率

经全身给药的药物可能出现的眼毒性一般可通过常规眼科检查来发现。给药前应进行一次全面的眼科检查，确认动物给药前的健康状况并建立给药前的基础数据。对于眼科制剂导致的眼内炎症反应通常出现在给药后第1天至第1周内，因此，通常设计为每次给药后第1，3和7天及下次给药前进行裂隙灯检眼镜检查。眼压检查时间点及频率根据药物特点进行选择。眼内注射由于注射体积导致的一过性眼压升高通常会在10～15 min内缓解。因此，通常在给药后1 h内和24 h进行眼压监测。

当试验过程中发现非预期的眼毒性，可在后续试验中通过方案变更增加相应的眼科检查，如增加监测频率和监测项目，包括眼底照相、荧光造影和电生理检查，至少在给药结束及恢复期结束时各进行1次，视药物具体情况及试验周期设置给药期内的其他时间检查点，并在更长周期的毒性试验中对可能的眼毒性进行重点关注。

2.6 样本采集和检测

对于根据作用靶点、作用机制预估存在眼毒性风险或试验过程中发现非预期眼毒性的药物，通常应考虑在试验中期、试验末期和恢复期采集眼组织进行相应的检查。眼组织采集通常需对多种眼组织进行精细分离和收集，包括眼睑、结膜、角膜、房水、虹膜、晶状体、玻璃体、视网膜、脉络膜和视神经等。此外，应同时采集与眼部异常相关的其他组织。

一般根据药物的代谢特征来确定相应的血样和眼组织样本的采集时间，采样时间点的选择原则可参考常规药代试验，即采样点应包括吸收相、峰浓度和消除相。血样采集量至少保证2～3次检测用量及一定备份血样，眼组织应尽量将每类组织取完整，所有样品一般采用-70℃以下保存。对于需要评估眼部组织中暴露量的药物，应在经过验证的药物稳定性时限内完成眼部组织的检测，考察药物在眼球各组织中的分布代谢情况并计算在各组织中的代谢参数。此外，可通过研究眼内给药后药物透过血眼屏障进入血液循环的全身暴露情况，计算药物入血率及其在血液中的代谢参数。由于目前暂无特异性的眼毒性生物标志物，建议根据研究药物特征及作用靶点开展针对性的特征分子的检测。

3 对眼毒性非临床安全性评价的综合分析

全身给药和眼部给药导致的眼毒性指征从病变性质方面看无本质差异，但眼部给药不良反应以眼内炎症居多。眼部常见的组织病理改变包括眼内各组织炎症细胞浸润、水肿、出血、新生血管形成、血管炎症、晶状体变性（白内障样改变）以及视网膜神经退变等。

由于非临床研究中采用的动物种属可能存在自发性眼部异常，因此确认该种属自发性眼部病变的种类、发生频率以及严重程度是判断眼部不良反应与药物相关性的重要前提。对于新入实验室的实验动物，应进行相关眼科检查。如猴眼的豹纹眼底，大鼠和小鼠玻璃体出血（可能为动物之间争斗引发）及眼底出血等，通常与药物无直接关联性；大鼠和小鼠饲养一定周期后，可能由于光照和年龄等原因，会产生视网膜变性、萎缩及晶状体变性（白内障）等自发病变［13］。

一般情况下，在非临床研究中动物用药后眼科检查如有影响视觉功能及视觉通路的眼内炎症和改变（如角膜混浊/水肿、晶状体混浊、前房渗出/积脓、玻璃体混浊、视网膜炎症、眼内出血等），可判定为药物导致的眼毒性表现，仅单纯的一过性房水细胞/玻璃体细胞增加而无其他眼组织与结构的异常变化，可认为是非毒性作用。例如，阿柏西普的食蟹猴重复给药毒性试验中，经玻璃体注射给药后，主要眼球异常表现为眼前节和玻璃体内出现轻微的、一过性细胞增多（解释为轻微的炎症反应），该体征与其他眼科异常无相关性。虽然猴出现上述体征的剂量约为人临床拟用剂量的1/2，但由于上述体征具有程度轻微和一过性的特点，因此并不一定意味着会带来明显的临床安全性担忧。如果电生理检查发现各波段时间延长、幅度降低等功能学方面的变化，以及眼OCT、眼底照相和（或）造影中发现了视网膜形态改变，则需充分考虑其毒理学意义。此外，还应关注经眼内注射（如玻璃体内注射）给药时的血浆和（或）房水中游离型和结合型药物的动力学特征，用于进一步分析和解释眼内注射给药后的毒性特征（包括免疫原性特点）。

此外，根据试验发现可能需要针对眼毒性进行针对性的追加研究，如根据药物的靶点和作用机制进行眼科相关的生物分布、组织病理等研究，以进一步明确非预期眼毒性是与药物直接相关或是间接的继发反应，并了解眼毒性的发生机制等。

4 结语

药物眼毒性常常由于药物的药理作用和毒性反应而引起，对眼组织产生功能性或器质性损害，最常受累部位为眼球结膜、角膜、晶状体、视网膜、视神经及眼外肌等，临床表现为眼睛炎症、眼压异常、视力障碍、色觉障碍和眼球运动障碍等［14］。尽管在临床试验和临床应用中可进行眼毒性的监测，但是暂时的视觉障碍和永久性的视力丧失均会给患者生活质量带来极大的影响。

以2011年上市的抗癫痫药物瑞替加滨（retigabine，商品名Potiga®）为例，因部分长期用药患者产生严重的剂量相关的皮肤及视网膜色素沉着等不良反应，2013年被美国FDA在说明书中加以黑框警告（视网膜异常和潜在的视力丧失），导致其因市场前景欠佳于2017年主动撤市。因此，在新药研究过程中需对眼毒性风险予以特别关注。

在毒理学研究中，根据药物特点及同类产品的非临床和临床应用信息，预先评估药物潜在的眼毒性风险，结合眼科检查和眼的组织病理学检查结果，并伴随必要的游离性和结合型药物在系统暴露量和（或）眼局部基质中的暴露量进行数据解读，对于深入且全面了解药物眼毒性特征具有十分重要的意义。

尽管包括眼毒性反应在内的动物体内的反应并不能全面地反映药物在人体的特征，但由本文案例可知，采用合适的非临床安全性评价策略，可在一定程度上提前预估人体出现相关不良反应的风险，并初步提示临床研究和人体应用时应采取的必要且重要的指标监控和风险控制措施，以最大程度保护用药者的安全，获得最佳的风险/获益比。