CYP3A4介导的睾酮和卡马西平与香芹酚的相互作用

李 洋，George Desideri KASHANGAKI，衣服新

（锦州医科大学附属第一医院神经外科，辽宁 锦州 121001）

香芹酚（carvacrol），即2-甲基-5-异丙基苯酚，是一种存在于百里香油等植物的天然活性物质［1］。现代药理学研究表明，香芹酚具有抗炎和抗氧化等多种药理活性［1-2］。近年来发现，香芹酚具有抗癫痫作用和神经元保护作用，受到广泛关注［3-5］。

细胞色素P450酶3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）是重要的药物代谢酶，＞50%上市药物是通过CYP3A4代谢，包括抗癫痫药物卡马西平［6-8］。卡马西平治疗窗窄，癫痫患者长期服用卡马西平的同时可能会服用中药或中药制剂，从而诱发药物不良反应［6，9-11］。因此，有必要评估中药活性成分对CYP3A4介导的卡马西平代谢的影响，有助于指导卡马西平临床合理用药。

卡马西平在体内经CYP酶代谢生成10个代谢产物，其中CYP3A4介导产生的卡马西平10，11环氧代谢物是主要代谢产物［7-8］。该反应可用作为探针反应考察CYP3A4的酶活性，还可用于中草药-卡马西平相互作用风险的筛查和评估［9-11］。除卡马西平外，睾酮、硝苯地平、红霉素和咪达唑仑等均是美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration，FDA）推荐的体外 CYP3A4探针底物［12-14］。但需要指出的是，CYP3A4晶体结构中存在多个底物结合位点［12-13］。使用不同CYP3A4探针底物获得的药物-药物相互作用（drug-drug interaction，DDI）数据可能存在差异。例如，α-萘黄酮不仅激活CYP3A4介导的咪达唑仑1′-羟化反应和硝苯地平氧化反应，还可抑制睾酮6β-羟化反应［15］。为提高预测准确率，当待测化合物和探针底物与CYP3A4的结合位点不一致时，应使用待测化合物本身作为底物开展DDI预测。

现有研究表明，香芹酚具有抗癫痫作用［5］。然而，香芹酚是否能与卡马西平等CYP3A4底物联用尚不清楚。本研究旨在应用人肝微粒体孵育体系比较香芹酚对CYP3A4介导的睾酮和卡马西平代谢的抑制作用。通过抑制动力学研究，阐明香芹酚对CYP3A4介导的卡马西平10，11-环氧反应的抑制参数和抑制类型。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

香芹酚、卡马西平、卡马西平10，11环氧化物、睾酮、6β-羟化睾酮、酮康唑、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）（Sigma-Aldrich公司，美国）；乙腈为色谱纯，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为分析纯，其他的试剂均色谱纯级（默克公司，德国）；人混合肝微粒体（上海瑞德肝脏疾病研究有限公司）。LC-10AVP高效液相色谱系统（SCL-10AVP系统控制器、LC-10ATVP双泵、SPD-10AVP紫外-可见光检测器、SIL-10ADVP自动进样器和CLASS-VP色谱工作站）（岛津，日本）；3-18KS高速离心机（Sigma，德国）；JHN-4F超声波清洗仪（上海杰恩普超声设备有限公司）；色谱柱为华普XAqua C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（大连华普公司）。

1.2 CYP3A4探针底物、反应体系和条件

采用睾酮和卡马西平双探针底物表征CYP3A4酶的催化活性。200 μL反应体系包括：磷酸钾缓冲液100 μmol·L-1（pH=7.4）、NADPH 系统（NADP+1 mmol·L-1，葡萄糖-6-磷酸10 mmol·L-1，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1 kU·L-1和氯化镁4 mmol·L-1），适合浓度的人肝微粒体（g·L-1），相应的探针底物和香芹酚（或阳性抑制剂酮康唑）。卡马西平10，11环氧化物及6β-羟化睾酮的生成速率在0～40 min反应时间和微粒体浓度范围（0.1～0.7 g·L-1）内呈线性，且探针底物的消耗量＜20%。因此，在单点法初筛香芹酚（100 μmol·L-1）中，人肝微粒体使用的终浓度为0.5 g·L-1；在抑制能力评价中，终浓度为0.2 g·L-1。卡马西平用乙腈溶解，反应体系中乙腈体积比为1.5%，以避免对CYP3A4活性的影响［16-17］。该体系下，液相法测定卡马西平的最大溶解度为 1 612 μmol·L-1。反应体系在 37℃条件下预孵3 min后，加入NADP+起始反应。20 min后，用200 μL的乙腈终止反应。然后20 000×g离心10 min，取10 μL上清HPLC进样分析。

1.3 通过抑制动力学考察香芹酚对CYP3A4酶活性的抑制作用

考察香芹酚100 μmol·L-1对CYP3A4介导的睾酮6β-羟化反应及卡马西平10，11环氧化反应抑制活性。如抑制率＞50%，选取不同浓度的香芹酚进一步求出其半数抑制浓度（IC50）。采用不同浓度的香芹酚（0～15 μmol·L-1）和卡马西平（0～1500 μmol·L-1），通过抑制动力学测定香芹酚对CYP3A4的抑制能力。Ki根据竞争性抑制方程①、非竞争性抑制方②和反竞争性抑制方程③通过GraphPad Prism 6.0软件非线性回归计算获得。

式中，Vmax是最大反应速度；Km是米氏常数；Ki是抑制常数，S是底物浓度；α是相关系数。

1.4 统计学分析

实验结果数据以±s表示，组间统计采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 香芹酚对CYP3A4酶抑制活性的单点初筛

香芹酚100 μmol·L-1显著抑制CYP3A4介导的卡马西平10，11环氧代谢物的生成，抑制残留活性为（22.7±1.4）%（P＜0.01）（图1）。然而，香芹酚100 μmol·L-1不能抑制CYP3A4介导的6β-羟化睾酮的生成。阳性对照酮康唑1 μmol·L-1几乎完全抑制CYP3A4酶的催化活性。表明香芹酚对CYP3A4的抑制活性具有底物依赖性。

Fig.1 lnhibitory effect of carvacrol and ketoconazole on CYP3A4 induced carbamazepine 10，11-epoxidation and testosterone 6 β-hydroxylation.Carvacrol 100 μmol·L-1 or ketoconazole 1 μmol· L-1was incubated with human liver microsomes（0.5 g·L-1）and probe（carbamazepine 500 μmol·L-1；testosterone 50 μmol·L-1）at 37℃ for 20 min.±s，n=3.＊P＜0.01，compared with corresponding control group.

2.2 香芹酚对CYP3A4酶活性的抑制作用

香芹酚对CYP3A4介导的卡马西平10，11环氧反应的抑制作用具有浓度依赖性（图2）。非线性拟合数据获得的相关系数R2值为0.9812，IC50值为（15.3±1.4）μmol·L-1。表明香芹酚对CYP3A4介导的卡马西平10，11环氧反应具有强抑制活性。

2.3 香芹酚对CYP3A4介导的卡马西平10，11环氧化反应动力学行为的影响

Fig.2 Effect of carvacrol on formation of carbamazepine 10，11-epoxide mediated by CYP3A4.Carvacrol（0-100 μmol·L-1）was incubated with human liver microsomes（0.2 g·L-1）and carbamazepine（500 μmol·L-1）at 37℃ for 20 min.±s，n=3.

考察抑制剂共存下酶动力学的变化是研究酶-抑制剂相互作用机制的重要方法。进一步研究发现，香芹酚共存时，CYP3A4介导的卡马西平10，11环氧化反应动力学行为发生改变：Vmax值随香芹酚浓度增加而减小，但香芹酚浓度增加对Km值影响不大，符合非竞争性抑制行为特点（表1和图3）。说明香芹酚和卡马西平与CYP3A4的结合位点不同。将非线性拟合获得的动力学参数代入式②，计算得Ki值为（14.1±1.0）μmol·L-1。

Tab.1 Effect of carvacrol on kinetic parameters of CYP3A4 mediated carbamazepine 10，11-epoxidation.

Fig.3 Effect of carvacrol on kinetic behavior of CYP3A4 mediated carbamazepine 10，11-epoxidation.Carvacrol（0-15 μmol·L-1）was incubated with microsomes 0.2 g·L-1and carbamazepine（0-1500 μmol·L-1）for 20 min.±s，n=3.

3 讨论

卡马西平是目前临床治疗癫痫复杂部分性发作的首选药。卡马西平在体内主要经CYP3A4和CYP1A2代谢，其中CYP3A4是其主要代谢酶，代谢贡献率为0.4～0.8之间［7-8，18］。由于卡马西平卡的治疗窗较窄，有必要评估与卡马西平联用的药物能否通过抑制CYP3A4诱发临床DDI。对大多数CYP亚型来说，选择一种高特异性的探针底物即可实现对酶活性的表征；探针反应也可用于对酶抑制剂的筛选及抑制机制研究。但这对于CYP3A4来说并不适用。截至目前，美国FDA推荐的睾酮、硝苯地平、红霉素和咪达唑仑等探针与CYP3A4的结合位点均存在差异［12-15］。此外，研究显示，卡马西平与睾酮的CYP3A4的结合位点也不同［19］。这与本研究结果相一致（图1），说明评价CYP3A4介导DDI应慎重选择探针底物。

香芹酚是一种天然单萜酚，广泛存在于牛至、百里香、冬季香薄荷和亚加菊等芳香植物挥发油中［2］。香芹酚具有抗炎和抗氧化等多种药理活性［1-2］。欧盟也将香芹酚纳入“大体安全”范畴［2］。当使用睾酮作为探针底物时，未发现其对CYP3A4的抑制活性，但使用卡马西平作为底物时，香芹酚表现出对CYP3A4的强抑制活性，抑制类型为非竞争性。根据FDA规定的药物体内最大暴露量与Ki之比＜0.1的警戒线推算［20］，香芹酚的体内暴露量＞1.41 μmol·L-1即可能导致 DDI风险。截至目前，香芹酚在人体内的药动学研究未见报道。但香芹酚在临床Ⅱ期研究中的用药量为每天 1.2 mg·kg-1［21］。在不考虑口服吸收及代谢情况下，香芹酚在体内的最大暴露量将达7.88 μmol·L-1。另外，值得注意的是，不同个体CYP3A4活性相差10～100倍［22-23］。对于低CYP3A4活性携带者，如CYP3A4＊22，联用香芹酚和卡马西平的风险随之加大［24］。因此，香芹酚与卡马西平联用可能存在风险，但仍需经过体内试验或FDA推荐的定量药理学方法加以验证。