柏薏颗粒对高尿酸血症大鼠的初步药效学分析

张婷，尹哲，杨阳，吴振，王立强

(1. 华侨大学 医学院，福建 泉州 362021; 2. 厦门大学 药学院，福建 厦门 361102)

现代医学认为在正常的嘌呤饮食情况下，非同日两次空腹测定血尿酸水平，男性血尿酸水平高于420 μmol·L-1，女性高于360 μmol·L-1即称为高尿酸血症(HUA)[1].研究表明，高尿酸已成为冠心病、冠状动脉粥样硬化性心脏、病急性心肌梗死等疾病的独立危险因素[2-6].目前，我国HUA患病人数已超过1.2亿，HUA成为继高血压、高血脂、高血糖之后的常见代谢性疾病[7].机体内尿酸水平的升高主要是由体内尿酸生成和排泄不平衡所致，而黄嘌呤氧化酶(XOD)是次黄嘌呤、黄嘌呤生成尿酸的关键限速酶，是研究降血尿酸机制的重要靶点[8].柏薏颗粒的基本处方来源于医院制剂，用于治疗高尿酸血症、痛风性关节炎、痛风石等疾病.在原方的基础上，加入萆薢、土茯苓、山慈菇、白芥子等药材，具有清热除湿、健脾补肾、降浊止痛、活血通络等功效.原方为汤剂，其推广和应用受到了限制.因此，本文在已完成柏薏颗粒处方及工艺研究的基础上，建立HUA大鼠模型，探究柏薏颗粒降血尿酸的作用及机制.

1 实验材料

1.1 药品与试剂

柏薏颗粒(实验室自制);非布司他(江苏万邦生化医药集团有限责任公司);氧嗪酸钾(深圳市博美生物科技有限公司);肌酐(Cr)试剂盒、尿素氮(BUN)试剂盒、黄嘌呤氧化酶(XOD)试剂盒、尿酸(SUA)试剂盒物(江苏省南京建成生物工程研究所);二奎啉甲酸(BCA)试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司);有机阴离子转运体1(OAT1)抗体(北京博奥森生物技术有限公司);葡萄糖转运体9(GLUT9)抗体(武汉三鹰生物科技有限公司);蛋白磷酸酶抑制剂复合物(100×)、Western一抗稀释液、Western二抗稀释液、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(5×)、SDS-PAGE电泳液(10×)、ZD304型快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western快速转膜缓冲液(10×)30 min转膜(电转液)、彩色预染蛋白质中分子量标准(1～180 kDa)、脱脂奶粉(北京庄盟国际生物基因科技有限公司);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(安徽省合肥市bioshap生物科技有限公司);特超敏ELC化学发光试剂盒(上海市碧云天生物科技有限公司);质量分数为10%的水合氯醛(上海源叶生物科技有限公司)；乙醚(北京益利精细化学品有限公司)；羧甲基纤维素钠(天津市福晨化学试剂厂)；无水乙醇(上海国药集团).

1.2 实验仪器

1200型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)、UV紫外可见分光光度计(美国安捷伦公司)；BSA124S型电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-500E型超声仪(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；涡旋仪(江苏省海门其林贝尔公司)；5430R型低温离心机(上海安亭科学仪器厂)；InfiniteM200型多功能酶标仪(瑞士帝肯公司)；DYY-74型电泳仪(北京市六一仪器厂)；TS-1型摇床、JR92-IIDN型超声波细胞破碎仪(浙江省宁波新芝生物科技股份有限公司)；发光成像仪(北京市大龙仪器有限公司)；制冰机(江苏省常熟市雪科电器公司)；超低温冰箱(上海市赛默飞公司).

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量为(200±25) g(福建省闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司).

2 实验方法

2.1 溶液的配制

人体柏薏颗粒的每日用量为90 g，以成人体质量70 kg为基准，可换算出大鼠临床等效剂量为8.10 g·kg-1，分别以等效剂量的4倍、2倍和1倍进行柏薏颗粒高(32.40 g·kg-1)、中(16.20 g·kg-1)和低(8.10 g·kg-1)剂量给药.取8 g羧甲基纤维素钠，加蒸馏水，加热搅拌，溶解后定容至1 000 mL，获得质量浓度为8 g·L-1的羧甲基纤维素钠；称取适量氧嗪酸钾溶于羧甲基纤维素钠溶液中，制得氧嗪酸钾溶液，以300 mg·kg-1剂量给药.称取适量非布司他溶于羧甲基纤维素钠溶液中，制得非布司他溶液，以3.6 mg·kg-1剂量给药.

2.2 分组与造模

将72只雄性大鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、柏薏颗粒低剂量组(简称低剂量组)、柏薏颗粒中剂量组(简称中剂量组)、柏薏颗粒高剂量组(简称高剂量组)、非布司他阳性对照组(简称非布司他组).空白组灌胃给予生理盐水，其余各组灌胃给药OA溶液，建立HUA大鼠模型；连续造模7 d后，乙醚麻醉，尾静脉取血检测血尿酸值；确定造模成功后，开始治疗给药.除空白组和模型组给予相应体积的生理盐水外，其余各组灌胃给予相应剂量的药物.连续给药14 d，每天给药一次，每7 d称量大鼠的体质量并观察变化趋势，同时,还需观察大鼠的活动状态、精神状态、毛发色泽、饮食及大小便情况.

2.3 尿酸浓度的测定

末次灌胃给药后，禁食12 h，正常饮水，腹腔注射0.8 mL的水合氯醛(10 g·L-1)麻醉后，心脏取血，静置2 h，于3 500 r·min-1离心10 min(4 ℃)，分离血清，测定血清中的尿酸浓度(c(SUA)).

2.4 肌酐和尿素氮浓度的测定

肌酐和尿素氮是肾小球滤过功能的重要指标，当肾小球受损时，滤过率降低，血清中的Cr，BUN浓度升高.使用Cr试剂盒与BUN试剂盒测定血清中的肌酐浓度(c(Cr))和尿素氮浓度(c(BUN)).

2.5 黄嘌呤氧化酶活性的测定

称取1.0 g大鼠肝脏组织，按体质量(mg)∶体积(μL)=1∶10的比例，加入预冷生理盐水，采用冰水浴，在低温条件下进行机械匀浆，制备肝匀浆，于3 500 r·min-1离心10 min(4 ℃)，取上清液.使用XOD试剂盒测定黄嘌呤氧化酶活性.

2.6 OAT1及GLUT9蛋白表达的测定

称取0.1 g肾脏组织，按体质量(mg)∶体积(μL)=1∶10的比例，加入组织蛋白(RIPA)裂解液及磷酸蛋白酶复合抑制剂混合液，将组织匀浆在冰上裂解30 min，提取组织蛋白，于3 500 r·min-1离心5 min(4 ℃)，取上清液，采用BCA法测定肝脏匀浆的蛋白浓度.用已知浓度的蛋白溶液稀释上样缓冲液(V(蛋白溶液)∶V(上样缓冲液)=4∶1)，沸水浴条件下使蛋白变性.按照试剂盒的使用说明，配制电泳分离胶及浓缩胶，待胶凝固后，拔出梳子，以避免气泡产生.按每孔30 μg上样SDS-PAGE电泳，在目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上结束电泳.根据标准蛋白分子量位置，切下目的蛋白及内参相对应位置的电泳胶，采用湿转法进行转膜，转膜后加入质量浓度为5 g·L-1的脱脂奶粉，室温条件下封闭1 h；加入一抗溶液后置于摇床上，4 ℃下孵育过夜，用杂交膜(TBST)冲洗液洗膜3次，每次10 min；加入二抗溶液后置于摇床上，4 ℃下孵育8 h，用TBST冲洗液洗膜3次，每次10 min；加入化学发光试剂，在发光成像仪上显影，用Image J软件进行处理，分析胶片的上目标条带的灰度值，观察柏薏颗粒对OAT1和GLUT9蛋白表达的影响.

3 实验结果

3.1 大鼠的体表状态

经观察发现大鼠的活动正常,精神状况无明显异常；毛发有光泽，外形无明显变化；饮食正常，尿便未出现明显异常现象.与空白组相比，模型组、柏薏颗粒低、中、高剂量组及非布司他组大鼠体质量的差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明柏薏颗粒对大鼠的正常生长代谢没有明显影响.大鼠体质量的变化情况,如图1所示.图1中：m为大鼠的体质量.

3.2 柏薏颗粒对血清尿酸浓度的影响

不同组别的血清尿酸浓度，如图2所示.图2中：与空白组相比，“**”表示P<0.01；与模型组相比，“△△”表示P<0.01.由图2可知：与空白组相比，模型组的血清尿酸浓度极显著升高(P<0.01)，说明采用OA灌胃给药法造模成功；与模型组相比，柏薏颗粒低、中、高剂量组的血清尿酸浓度均显著下降(P<0.01)，说明柏薏颗粒具有降尿酸的作用，且随着给药剂量的增加，尿酸浓度逐渐下降，柏薏颗粒降尿酸作用呈剂量依赖性；高剂量组与非布司他组降尿酸效果明显(P<0.01).

图1 大鼠体质量的变化情况 图2 不同组别的血清尿酸浓度Fig.1 Weight changes of rat Fig.2 Serum uric acid concentration in different groups

3.3 柏薏颗粒对血清肌酐和尿素氮浓度的影响

柏薏颗粒对血清肌酐浓度和尿素氮浓度的影响，分别如图3，4所示.由图3，4可知：各组肌酐浓度和尿素氮浓度之间的差异不显著，说明柏薏颗粒对HUA模型大鼠具有明显的肾脏保护作用，柏薏颗粒无肾损伤，适合长期服用.

图3 柏薏颗粒对血清肌酐浓度的影响 图4 柏薏颗粒对血清尿素氮浓度的影响Fig.3 Effect of Baiyi granules on serum creatinine concentration Fig.4 Effect of Baiyi granules on serum urea nitrogen concentration

3.4 柏薏颗粒对HUA大鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶活性的影响

表1 HUA大鼠肝脏中的黄嘌呤氧化酶活性 Tab.1 XOD activity in HUA rat liver

3.5 柏薏颗粒对OAT1和GLUT9蛋白表达的影响

HUA大鼠肾脏匀浆中OAT1和GLUT9的蛋白条带图，如图5所示.柏薏颗粒对OAT1和GLUT9蛋白表达的影响,分别如图6，7所示.图6,7中：与空白组相比，“**”表示P<0.01；与模型组相比，“△”表示P<0.05，“△△”表示P<0.01；k(OAT1)，k(GLUT9)分别表示OAT1，GLUT9蛋白相对表达水平.

由图6，7可知：与模型组相比，柏薏颗粒高剂量组能显著地降低肾脏GLUT9蛋白相对表达水平(P<0.05)，柏薏颗粒中、低剂量组也有降低GLUT9蛋白相对表达水平的作用，但无显著差异，非布司他组极显著降低肾脏GLUT9蛋白相对表达水平(P<0.01)；与模型组相比，柏薏颗粒高、中剂量组均能显著上调肾脏OAT1蛋白表达水平，柏薏颗粒高剂量组上调OAT1蛋白表达的作用与非布司他组相当(P<0.01)，但柏薏颗粒低剂量组对OAT1作用的差异无统计学意义.这说明柏薏颗粒的降尿酸机制与抑制肾脏GLUT9蛋白的表达减少尿酸重吸收，以及上调OAT1蛋白表达促进尿酸的分泌有关.

(a) OAT1 (b) GLUT9图5 免疫印迹法蛋白条带图Fig.5 Western blot protein band diagram

图6 柏薏颗粒对OAT1蛋白表达的影响 图7 柏薏颗粒对GLUT9蛋白表达的影响Fig.6 Effect of Baiyi granules on OAT1 protein expression Fig.7 Effects of Baiyi granules on GLUT9 protein expression

4 讨论

目前，医学上多采用西药对HUA持续降酸治疗，主要有别嘌醇、非布司他、丙磺舒、苯溴马隆等.这些化学药物虽然及时治疗效果明显，但临床上长期服用都有较为明显的不良反应，病情具有反复性，且患者依从性较差[9-11]，因此，亟需开发一种药效持久、不良反应少的新药物.根据中医学理论，中医药在治疗高尿酸血症方面具有多成分、多靶点、多途径、持久温和、长期服用不良反应少等优点.柏薏颗粒组方来源于国内医院的临床经验方，可显著降低大鼠SUA浓度，具有明显的降尿酸作用.肾小球的滤过功能决定了血清中Cr的浓度，人体内蛋白质以BUN的形式代谢，产生最终末产物.各种肾病变均可使血液中Cr和BUN水平升高，而连续14 d服用柏薏颗粒，大鼠血清中的Cr和BUN浓度无明显变化，表明柏薏颗粒对大鼠无肾损伤.后期可对柏薏颗粒进行急性毒性实验考察，进一步验证其安全性.

在高尿酸血症的造模方法中，OA造模法最为常见，该法简单易行且模型稳定.OA为尿酸酶抑制剂，其结构与尿酸的嘌呤环相似，可竞争性地与尿酸酶结合，抑制体内尿酸的降解过程，能明显升高大鼠体内血尿酸浓度，与人体内的嘌呤代谢过程相似.由于大鼠体内存在尿酸酶，可将体内尿酸进一步分解为尿囊素等物质排出体外.因此，建模成功后，随着时间的延续，大鼠体内的尿酸浓度有降低的趋势.

正常状态下，人体内尿酸的生成和排泄基本上保持动态平衡.XOD是尿酸生成的关键酶，XOD活性升高或嘌呤代谢酶缺陷导致嘌呤利用障碍是尿酸水平升高的主要原因.研究表明，90%的原发性高尿酸血症的病因与尿酸在肾脏的排泄减少有关[12].尿酸的排泄要经过肾小球滤过、近端小管重吸收、近端小管分泌及近端小管分泌后重吸收4个步骤[13]，涉及到多种尿酸转运蛋白，主要分为尿酸重吸收蛋白(如尿酸阴离子转运体1(URAT1)、GLUT9)，以及尿酸分泌蛋白(如有机阴离子转运体(OATs)、尿酸转运体(UAT)、多药耐药蛋白4(MRP4)等).大多数有机阴离子转运蛋白(OAT)家族的成员是有机阴离子交换转运体，其介导某种阴离子进入细胞的同时，释放另一种阴离子到细胞外.OAT1介导细胞外有机阴离子与细胞内的α-酮戊二酸交换，能够转运尿酸.黄嘌呤、次黄嘌呤、皮质酮类激素和维生素盐酸盐等内源性化合物能够抑制OAT1，减少尿酸分泌.GLUT9主要在人体肝、肾中表达，其转运活性可能受胞内己糖浓度的影响，与URAT1协同完成对肾小管滤过的尿酸盐的重吸收.肾脏表达的GLUT9介导尿酸重吸收，独立于其他已知的尿酸转运体，寻找有效的GLUT9抑制剂是促尿酸排泄的另一重要靶点[14-17].实验结果表明，柏薏颗粒可显著抑制GLUT9表达，并上调OAT1蛋白表达，表明其降尿酸机制可能与这两个尿酸转运体有关.后期实验可增设柏薏颗粒对其他蛋白和因子的影响，以完善柏薏颗粒降尿酸的物质基础.

由于柏薏颗粒由多味中药材组成，因此，相较于化学药物，柏薏颗粒的作用机制相对复杂，有的药物能够抑制尿酸的生成，有的药物具有促进尿酸排泄的作用，有的药材可协同保肝益肾，而各味药材的具体作用机制及影响权重尚不明确，需进行进一步的研究.此外，高尿酸血症病人在病情发作期常伴随着红肿热痛等急性期症状，而本组方中加入了黄柏、苍术、薏苡仁、川牛膝等多味可减轻炎症反应的中药材，可能对痛风急性期的红肿热痛也具有一定的治疗效果，有待实验进一步证实.