不同中药配方颗粒药渣栽培灵芝研究

蔡 良，欧阳冬青，施华蓉，吉小宝

(江西百神药业股份有限公司/江西省中药配方颗粒重点实验室， 江西 宜春 336000)

我国是食用菌的生产、消费及出口大国。随着食用菌行业的快速发展，土地和林木资源的短缺，传统的棉籽壳、玉米粉等原料价格不断攀升，使得菇农的生产成本提高，利润下降，生产积极性受挫。同时棉籽壳等原料还存在农药残留率高导致我国食用菌国际竞争力疲软。因此，开发新的廉价绿色有机原料对于促进食用菌行业发展意义重大[1]。中药渣是一种具有经济价值的资源，目前已有较多研究表明中药渣可用于平菇、灵芝、杏鲍菇等食用菌栽培，不仅可以实现资源再利用，解决环境污染问题，还可以降低菇农的生产成本[1-2]。中药配方颗粒药渣为单味饮片水提后废弃的药渣，与一般中药渣对比，药材来源固定，组分简单，不同品种药渣经脱水干燥后可以随机搭配组合进行配料，且药渣没有醇提、醇沉等生产工序，相对而言有更多的有效成分残留在药渣中，其营养更丰富。目前各类中药配方颗粒生产企业达60余家，产业规模已达近200亿元，产生的药渣量大，如江阴天江药业有限公司每年因生产配方颗粒产生药渣约达7 500 t，除约1 200 t制备成有机肥外，其余均需要环保部门焚烧处理[3]。因此中药配方颗粒药渣是一类食用菌潜在的廉价绿色有机原料。灵芝是我国著名的药食两用真菌，具有较高的药用及保健价值[4]。灵芝的主要活性物质有灵芝多糖和灵芝三萜，具有广泛的药理活性[5]。为探究中药配方颗粒药渣栽培灵芝的效果，采用江西百神药业股份有限公司6种药食同源中药配方颗粒药渣进行灵芝代料栽培，对各种药渣栽培的灵芝生长情况、产品性状及质量(以灵芝多糖与三萜类物质为指标)进行分析研究，考察中药配方颗粒药渣作为灵芝栽培原料的可行性。同时，挑选3株子实体采用组织分离法制备菌种，考察操作的可行性及重现性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

G-I赤芝菌种(自制)。

1.2 培养基

1.2.1复苏驯化培养基 黄豆粉1.5%、山药0.2%、玉米粉2%、麸皮0.3%、磷酸二氢钾0.1%、葡萄糖2%、硫酸镁0.05%、维生素B110 mg·L-1、酵母粉0.3%、琼脂2% 。将硫酸镁、磷酸氢二钾、葡萄糖、维生素B1、酵母粉5种物料用水溶解，备用。然后将黄豆粉、玉米粉、麸皮和切碎的山药加水混合均匀后，加热、搅拌，煮沸30 min，再经8层纱布过滤。将上述两种溶液合并混匀，定容至配制量，分装于三角瓶中。

1.2.2固体培养基 配方1(CK)：棉籽壳89%、麸皮10%、石膏粉1%；配方2[6]：棉籽壳63%、黄芪药渣20%、玉米粉10%、麸皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方3：棉籽壳63%、川芎药渣20%、玉米粉10%、麸皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方4：棉籽壳63%、白术药渣20%、玉米粉10%、麸皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方5：棉籽壳63%、人参药渣20%、玉米粉10%、麸皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方6：棉籽壳63%、党参药渣20%、玉米粉10%、麸皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方7：棉籽壳63%、酒苁蓉药渣20%、玉米粉10%、麸皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%。

其中配方1为对照(CK，不加中药渣)。每个配方制备菌包4包，每包干重700 g，配料时按照料水比1∶1.5，不调节pH，拌好后，常温闷堆2 h后再搅拌1次，装入聚丙烯袋(规格：17 cm×35 cm×0.05 mm)，并将接种棒塞进基质中压实，套好出菇环，121℃灭菌1.5 h。

1.2.3组织分离培养基 PDA培养基：马铃薯20%、山药2%、葡萄糖2%、琼脂2%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.1%、维生素B110 mg·L-1，将葡萄糖、琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1加水溶解，备用。然后将马铃薯和山药加水混合均匀后，加热、搅拌，煮沸30 min，再经8层纱布过滤。将上述两种溶液合并混匀，定容至配制量，分装于三角瓶中。

1.3 主要试剂及仪器

1.3.1主要试剂 葡萄糖、KH2PO4、MgSO4(西陇化工试剂有限公司)；棉籽壳、石膏粉、蔗糖、玉米粉、黄豆粉、麸皮、山药(市购)；酵母粉(英国OXOID公司)；黄芪、川芎、党参、人参、白术、酒苁蓉等药渣(中药配方颗粒药渣经干燥处理后获得)；无水葡萄糖与齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究院)，除硫酸优质纯外其余检测试剂均为西陇化工试剂有限公司分析纯试剂。

1.3.2主要仪器 Neofuge 15R 高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)；UV-2600紫外可见分光光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]；CJ超净工作台(浙江新丰医疗器械有限公司)；LRH-250生化培养箱(浙江新丰医疗器械有限公司)；XG1.D脉动真空灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；奥林巴斯CX23显微镜(上海普赫光电科技有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1菌种制备 将斜面菌种转接至复苏驯化培养基中，于28℃培养箱中培养3～5 d，待菌丝接近长满平皿时，收种备用。

采用配方1(CK，不加中药渣)制备菌包，将平皿菌种用接种刀切成小块(约0.5 cm2)接种至菌包，为保证菌丝更快的长满，取出接种棒后在菌包的上中下均接菌种3小块。接种后放置在自制的大棚盖好遮阳网避光培养，控制温度在26～30℃，每天通风2次，每次1 h。菌包培养时间约30 d，待其长满菌袋后方可用于子实体栽培接种用。

1.4.2灵芝子实体栽培 (1)不同培养基对菌丝体及子实体生长影响。按照1.2.2培养基制备菌包，取出接种棒后，手工接种菌种后转移至大棚培养，经暗培养菌包长满菌丝后，除去遮阳网进行光照培养，菌丝培养过程通过喷淋自来水及通风控制温湿度，控制温度26～30℃，湿度60%～70%；光照培养过程控制温度26～30℃，湿度85%～95%。记录灵芝菌丝体及子实体各个生长情况，对其生长形态进行拍照。(2)不同培养基子实体经济形状比较。按照1.2.2培养基制备菌包，参照1.4.2(1)方法进行接种培养，对第1茬灵芝子实体的生长周期、直径、厚度、重量进行记录。其中生长周期以接种后至菌盖黄白色生长圈停止生长后计，子实体直径与厚度采用游标卡尺测定，子实体重量采用电子天平称重，子实体直径、厚度、重量均为各配方子实体的平均重量。(3)子实体多糖及三萜与甾醇测定。收集生长较好的子实体，按照1.5分析方法进行检测，对比不同栽培料培养的子实体多糖及三萜与甾醇的差异。(4)灵芝菌种制备。挑选子实体个大，开伞至4～6分的幼嫩子实体，取菌盖边缘的白色生长圈，将菌盖边缘白色生长圈切成约0.5 cm2大小，用300 mL左右无菌水洗净后，转接至平皿，分离1～3次即得纯种菌株。观察菌丝性状、生长速度、并进行显微鉴别。

1.5 测定方法

灵芝多糖的测定，三萜及甾醇测定参照2015版《中国药典》灵芝药材检测方法检测[7]。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对灵芝菌丝及子实体生长情况的影响

从试验结果(表1)可知，各配方在菌丝生长及子实体生长情况差异明显。配方2、3、5发菌时间较配方1(CK，不加中药渣)快，其他配方发菌速度则相对较慢。菌丝外观及长势方面较好的是配方1～3(表1)。考察不同培养基对灵芝子实体生长情况，发现配方3～4菌丝培养及原基分化时间最长，而配方5～6菌丝生长及原基分化时间则较短(表2)。培养过程菌丝生长及子实体生长差异可能与培养基中的营养成分及原料结构的坚硬程度有关[8-9]。

表1 不同培养基栽培灵芝菌丝生长情况

表2 不同培养基子实体生长各阶段所需时间

2.2 不同培养基对灵芝子实体形状及产量的影响

7个配方培养基均能出菇，且灵芝子实体均能正常生长，但外观形态及色泽有明显区别。其中形态及色泽较好的是配方1～4，灵芝形态呈肾形、半圆形，表面为黄褐色至深黑色。配方6、8色泽较好，子实体表面有明显的漆状光泽(图1)。

从表3可以看出，配方2、5的生长周期较配方1(CK，不添加中药渣)短，其他配方培养周期相近。配方3(添加川芎药渣)子实体产量较其他配方高，每包子实体产量达到28.77 g以上。说明质硬川芎、白术药渣栽培灵芝虽然生长时间长，但其栽培的子实体形态较好，且芝盖大而厚实，产量相对较高，而人参、黄芪等相对质软的药渣虽然生长周期较短，但子实体相对小而薄，产量相对较低。

2.3 灵芝子实体多糖与三萜及甾醇含量对比

挑选配方1～5栽培的子实体进行含量检测，检测结果(表4)表明栽培的灵芝子实体多糖与三萜及甾醇含量均达到《中国药典》中规定的含量(多糖不得少于0.90%，三萜及甾醇不得少于0.50%)要求，不同培养基栽培的灵芝子实体含量差异较大，其中配方3(添加川芎药渣)栽培灵芝子实体含量最高，其多糖含量为2.14%、三萜及甾醇含量为1.03%，分别为配方1(CK，不添加中药渣)的1.35、1.49倍。且添加中药渣栽培料栽培的灵芝子实体三萜及甾醇含量普遍较单纯使用棉籽壳对照高，说明栽培料添加部分中药渣进行灵芝栽培有利于灵芝子实体三萜及甾醇含量的提高。

表3 不同培养基栽培灵芝子实体经济形状比较

表4 不同培养基栽培灵芝子实体多糖与三萜及甾醇含量

2.4 灵芝子实体组织分离方法

取配方2、5、6栽培开伞至4～6分的幼嫩子实体，取子实体菌盖边缘的白色生长圈，将菌盖边缘白色生长圈切成约0.5 cm2大小菌块3～4块，用300 mL左右无菌水洗净后，转接至平皿，待平皿中菌丝长至1 cm左右，切成3～4小块转接至平皿，如此反复分离1～3次直至得到纯种菌株。转移至平皿的子实体菌丝生长较快，培养3～4 d即可长满平皿，转接至平皿长出菌丝只需长至1～2 cm方便切块即可再次分离。本试验方法从获得幼嫩的子实体到分离获得纯种的周期最长约需9 d，如果在操作过程中控制好操作及环境且无菌水清洗子实体到位，1次分离便得到纯种菌株，本试验配方2子实体分离的灵芝菌种即只分离了1次便得到纯种，通过挑选3株不同子实体制备菌种，均能制备得到纯种菌种，说明此方法重现性较好。与G-I菌株对比，3株子实体组织分离得到菌种菌丝洁白，致密(图2)，长满平皿时间缩短约1 d，经显微镜鉴别，能够观察到明显的锁状联合及芽头结构(图3)。

3 结论与讨论

通过对不同培养基进行灵芝子实体代料栽培研究，综合评比了灵芝菌丝生长、子实体经济形状及对灵芝多糖及三萜类物质含量测定，结果表明添加川芎药渣培养基(配方3)、白术药渣培养基(配方4)与配方1(CK，不添加中药渣)相当，特别是添加川芎药渣栽培灵芝子实体产量及活性成分含量均优于配方1(CK，不添加中药渣)，且研究发现添加中药渣作为栽培基质灵芝三萜类物质含量均高于配方1(CK，不添加中药渣)，而三萜类物质作为主要活性物质具有抗过敏和抗发炎的作用，因此采用中药配方颗粒药渣替代部分棉籽壳作为灵芝栽培原料，在提高灵芝品质方面有很大的意义。同时本试验建立了一种子实体组织分离方法制备灵芝菌种方法，该方法制备操作简单，周期短，重现性好，只需配备简单的灭菌装置、超净台即可实现灵芝菌种的保种，适合专业技能不强的菇农操作。

随着中医药事业的快速发展，对中药生产过程产生的大量药渣进行综合利用，更好地发挥中药的资源价值，提升利用效率，不仅可以节约资源，延伸经济产业链，还可以减轻生态环境污染和社会压力[3]。本试验中药配方颗粒药渣作为栽培基质，由于在药材源头就进行农药残留与重金属把关，能够避免农药残留及重金属超标问题。同时配方颗粒采用单味药材水提其得到的药渣与其他复方制剂药渣对比成分相对固定，醇溶性、脂溶性成分残留较多，这些成分中有各种药理作用的有效成分，如川芎中的川芎嗪以及阿魏酸在心脑血管、中枢神经系统、呼吸系统等具有较好的药理作用[10]，黄芪含有皂苷类物质、黄酮类、氨基酸类、多糖类等有效成分，其中黄芪多糖具有增强机体抗疲劳及应激力、清除自由基抗衰老[11]、调节血糖等作用[12]，已有文献报道灵芝生长过程中能够富集多种矿物元素[13-14]，还有研究人员提出采用药渣栽培后灵芝具有药渣中的有效成分[1]。下一步将重点研究药渣中有效成分在灵芝子实体内是否也存在类似富集现象及药渣栽培后灵芝的是否也具有相应的药理作用。