早期胚胎停育患者中绒毛染色体异常的相关因素分析

黄晓珍 刘明星 许培 李浩贤 欧妙娴 梁彩虹

广州医科大学附属第三医院妇产科（广州510150）

胚胎停育，是指胚胎发育到早孕期即发生死亡，发病率为10%～15%［1-2］，＞80%为孕12周内的流产。复发性流产（recurrent pregnancy loss，RPL）为连续2次以上的流产，其在育龄女性中的发病率为1% ～5%［3］。其病因复杂，与遗传因素、生殖解剖结构异常、内分泌紊乱、感染、免疫失衡、血栓前状态、男方精液因素、环境因素以及个人不良生活习惯等有关［3］。明确流产原因，有利于减轻夫妻双方身心、经济负担，指导下一次妊娠，减少反复流产的发生。近50% ～70%流产绒毛可检测出染色体异常，特别是在复发性流产者中，出现率高达60%［4］。染色体数目异常最常见，发病率高达90%，其中约60%为三体，20%为单体，15%为多倍体，嵌合体约占2%，而染色体结构异常率为6%［5］。关于遗传因素导致流产的机制及如何预防遗传因素导致的不良妊娠，一直是优生优育协会的研究重点之一。本研究通过回顾性分析本中心536例早期流产患者的绒毛染色体分析结果，探讨绒毛染色体异常与早期胚胎停育的相关性及胚胎染色体异常的分布情况；研究胚胎染色体异常的危险因素，为临床指导优生优育提供证据支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2016年1月1日至2019年6月1日于广州医科大学附属第三医院确诊为早期胚胎停育、行绒毛G显带染色体核型分析或染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis，CMA）成功的患者共536例。

1.2 纳入标准及排除标准

1.2.1 纳入标准B超提示宫内单胚胎停育；夫妻双方染色体正常；流产绒毛染色体分析成功。

1.2.2 排除标准多胎妊娠、异位妊娠或宫内外复合妊娠；夫妻一方或双方染色体异常；不能成功检测流产绒毛染色体；孕期接触有害物质；合并生殖解剖结构畸形、感染、血栓前状态、免疫紊乱及严重全身性疾病等。

本研究通过本院伦理委员会批准，患者均为匿名收集，数据仅用于统计分析。

1.3 方法（1）患者及其家属签署药物流产或清宫的手术知情同意书及样本留取同意书，留取流产绒毛；（2）根据病人意愿选择行G显带染色体核型分析或CMA分析，流产绒毛送往本中心妇产科研究所临床试验部；（3）绒毛细胞培养及核型分析：挑取绒毛组织20 mg，剪成糊状，加入1 mL酶解液，37 ℃水浴箱放置15 min；离心10 min，弃上清，加入4 mL培养液，吹打均匀后接种于25 cm2培养瓶中，置37 ℃、5% CO2温箱内培养7 d，培养至显微镜下可看到10个克隆时加入秋水仙碱收获，G显带。每份标本计数30个分裂相，分析3个核型，出现嵌合体计数100个分裂相。G显带染色体核型分析结果根据国际人类细胞遗传学命名系统（ISCN2013）描述；（4）CMA分析：采用Affymetrix公司供给的CytoScan HD芯片进行样本单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism；SNP）和拷贝数变异（copy number variant；CNV）检测。进行样本限制性酶内切、引物结合片段连接、PCR扩增、PCR产物片段化处理、生物素荧光标记、杂交和洗涤等步骤。芯片结果分析软件为AGCC（Affymetrix GeneChip Convert Console）和CHAS（Chromosome Analysis Suite Version 2.0.0）。

1.4 分组根据流产绒毛染色体分析结果分为正常组和异常组。

1.5 临床指标收集收集两组患者的临床指标，如患者年龄、孕次、流产次数、活产史、生化妊娠史、此次受孕方式、此次发现胎停的孕周等。

1.6 统计学方法采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。其中，组间率比较采用χ2检验或Fisher精确检验，多因素分析采用二分类logistic回归分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 早期胚胎停育患者绒毛染色体异常的分布536例早期胚胎停育者中，检出染色体异常的有331例，发生率为61.8%。经染色体核型分析和CMA分析检出染色体数目异常的有319例，发生率为59.5%（319/536），其中常见的依次是三体（70.2%）、三倍体（11.0%）及（45，X）（9.4%）。经CMA分析检出染色体结构异常的有12例，发生率为5.4%（12/221）最常见的是缺失（66.7%）。

2.2 绒毛染色体三体的分布见图1，三体以16-三体最常见，发生率为30.4%，随之是22-三体，发生率为21.9%。

2.3 绒毛染色体异常危险因素的单因素和多因素分析将早期胚胎停育患者的年龄、孕次、活产史、生化妊娠史、流产次数、辅助生殖受孕等指标进行分层，分别在两组患者间作单因素分析，结果显示，不同年龄组、有活产史组和无活产史组、自然受孕组和辅助生殖受孕组的染色体异常率差异均有统计学意义（P ＜0.05），比较不同孕次组、有生化妊娠史组和无生化妊娠史组、不同流产次数组的染色体异常率差异无统计学意义（P ＞0.05，表1）。将具有统计学差异的单因素协变量纳入二分类Logistic回归分析（向前法），结果显示患者高龄是是绒毛染色体异常的危险因素，而辅助生殖受孕是是保护因素。见表2、3。

2.4 不同年龄组中不同类型绒毛染色体异常率的比较见表4，35岁组的数目异常率、非整倍体率、三体率及复合三体率均明显高于＜35岁组（P ＜0.05）。两组的单体率、嵌合体率及三倍体率差异无统计学意义（P ＞0.05）。

图1 不同类型染色体三体的分布Fig.1 Distribution of different types of chromosome trisomy

表1 绒毛染色体异常相关因素的单因素分析Tab.1 Univariate analysis of factors related to villi chromosome abnormalities 例

表2 绒毛染色体异常可能危险因素编码表Tab.2 Coding table of possible risk factors of villi chromosome abnormality

2.5 不同受孕方式组中不同类型绒毛染色体异常率的比较见表5，辅助生殖受孕组的数目异常率及三倍体率均低于自然受孕组（P ＜0.05）。两组的三体率、单体率、嵌合体率及复合三体率差异无统计学意义（P ＞0.05）。

3 讨论

流产组织的遗传学分析，证实了胚胎染色体异常是自然流产的主要原因［6-7］有胚胎染色体异常史的夫妻双方可行胚胎植入前遗传学诊断，减少因遗传因素导致的后续不良妊娠［8］。本研究中早期胚胎停育患者中绒毛染色体异常的发生率为61.8%，高于RUSSO等［9］报道的50.3%。推测原因有：（1）本中心并非流产患者都行绒毛染色体分析，胚胎染色体异常的流产妇女占比更大；（2）RUSSO等［9］研究采用荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization；FISH），检测染色体数目异常的成功率高，且不能检测染色体结构异常；（3）本研究染色体异常组中高龄患者占44%，有一定的偏倚。另外，本研究发现不同流产次数患者的胚胎染色体异常率相当，与YANG等［10］报道一致。因此，首次或多次流产患者，均有胚胎染色体异常的发生，有条件建议行流产组织的遗传学检查。

胚胎染色体异常中以数目异常最常见，结构异常仅占极少数。数目异常中以非整倍体常见，如三体、性染色体单体等。整倍体中以三倍体常见。JIA等［11］检测832例流产标本，发现16、22三体出现最多，与本研究结果一致。三体出现的可能原因是卵母细胞在减数分裂Ⅰ期间一条或数条染色体不分离导致的非整倍体。随着女性高龄，三体的发生率增加，染色体三体类型集中。本研究中嵌合体的检出率为3.6%，稍低于彭继萍报道的5.79%［12］，明显低于报道的30%不等［13］，考虑与嵌合体本身特性、实验人员技术、不同检测方法标准不一有关。

表3 绒毛染色体异常危险因素二分类Logistic 回归结果Tab.3 Results of binary logistic regression of risk factors for villi chromosome abnormality

表4 不同年龄组中不同类型绒毛染色体异常率Tab.4 Rates of different types of villi chromosome abnormality in different age groups 例（%）

表5 不同受孕方式组中不同类型绒毛染色体异常率Tab.5 Rates of different types of Chromosome abnormalities in different conception groups 例（%）

高龄是胚胎染色体异常的独立危险因素之一［14-15］。本研究中，相比＜35岁女性，35岁女性发生胚胎染色体异常的风险增加3倍以上，而对于40岁女性则风险增加近6倍。女性高龄、卵巢功能下降、卵母细胞的线粒体数量及功能异常、纺锤体聚合检验点蛋白及cohesion减少影响纺锤体的聚合，导致胚胎染色体减数分裂早期染色体分离错误［9］。胚胎移植前产前诊断开展以来的临床实践也证实了这一点［16］。因此，预防胚胎染色体异常导致的胚胎停育，实现优生优育，尽早受孕是重要举措。

辅助生育技术的蓬勃发展使得妇女总体受孕率极大提高，但成功妊娠率却低于30%［17］。有研究认为，注射大量促性腺激素释放激素激动剂、卵细胞体外培养的氧化应激、精子注射到卵细胞浆内损伤细胞骨架或纺锤体［18-20］，均可能导致染色体的分离错误。但另有研究指出，辅助生育技术并不会增加胚胎染色体异常率［21-22］。本研究中辅助生育受孕患者发生胚胎染色体异常的可能性更小，特别是三倍体事件的发生，考虑可能与胚胎移植前常规进行胚胎形态学评分，优选胚胎期间淘汰染色体可能异常、发育潜能低的胚胎等有关。MINASI等［23］学者也指出，囊胚移植前进行形态学评分，如评分高，其非整倍体发生率显著低于形态评分差的囊胚。

本研究为单中心、单种族的回顾性研究，只纳入了部分早期流产患者，受地域、人群、时间限制；另外，缺乏男方临床资料以及对患者生活环境、习惯的调查。通过多中心、多种族、长时间的前瞻性研究能够明确上述问题，从而更好地提高临床咨询和早期干预管理工作质量，更好实现优生优育。

综上所述，胚胎染色体异常是早期胚胎停育的主要原因，以三体、三倍体及（45，X）较常见，三体中常见16、22-三体。女性高龄与胚胎染色体非整倍体率升高呈正相关；采用辅助生殖技术受孕不会增加胚胎染色体异常的发生。