基于网络药理学探讨粉防己碱抗肿瘤的潜在作用机制

刘 伟，张彦忠，白素平，房立真

0 引言

粉防己碱(Tetrandrine，Tet)是从防己科植物粉防己(Stephania tetrandra SMoore)根中提取的一种生物碱，又名汉防己甲素，是粉防己的主要活性成分，其口服或注射剂型在临床上广泛用于风湿痛、关节痛、神经痛及硅肺等相关疾病的治疗。现代药理研究表明，粉防己碱(图1)具有消炎、镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗多药耐药等活性[1]。越来越多的研究显示，Tet具有较好的抗肿瘤活性[2]，但由于中药成分的多样性和作用机制的多靶点、多通路的特点，Tet的抗肿瘤作用机制的实验研究仍面临着诸多挑战，因此，借助网络药理学的方法对其作用机制进行系统性研究具有重要意义。

图1 粉防己碱化学结构

网络药理学是在数据库检索、高通量组学数据分析和计算机模拟等手段基础上，通过多层次网络构建及分析，从而系统地研究药物、靶点、疾病之间的相互作用，阐明药物的作用机制，是一门提高药物发现效率的新兴学科[3-4]。因此,本研究基于网络药理学和反向分子对接分析方法，以Tet为研究对象，通过建立“成分-靶点-通路”网络，全面系统地预测和发现作用靶点，以阐释其抗肿瘤作用机制，为深入揭示Tet的药理作用提供支持。

1 材料与方法

1.1 反向分子对接及抗肿瘤相关靶点的筛选 登录PubChem服务器，查询并下载Tet的3D分子结构式，储存为*.sdf格式。然后将Tet.sdf文件上传PharmMapper数据库[5]进行模拟分子-靶蛋白对接，进一步通过UniProt数据库将靶点的Uniprot ID转换为Gene Symbol。利用GeneCards数据库以“anticancer或antitumor”为关键词，收集与抗肿瘤相关的基因，将挖掘得到的抗肿瘤相关基因与药物靶点基因映射筛选出共同基因，从而得到Tet抗肿瘤作用靶点。

1.2 化合物-抗肿瘤靶点网络的构建 将筛选得到的抗肿瘤靶点蛋白在STRING 11.0平台[6]构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)，设置物种为人、最低相互作用评分>0.4，获取靶点蛋白相互作用关系，再运用Cytoscape 3.7.0软件[7]进行绘图，并对网络进行分析，设置结点颜色和大小以反映degree的大小，获得最终的蛋白相互作用网络。

1.3 分子对接验证 根据其PPI网络中拓扑参数(度数和接近中心度)进行分析，筛选出核心靶点，将其输入Systems Dock Web Site(Version 2.0)[8]与Tet进行分子对接验证，通过Docking Score评价Tet与靶点间的结合活性。

1.4 生物功能与通路富集分析 KOBAS是用于基因/蛋白质功能注释和功能集富集的Web服务器[9]。将Tet的抗肿瘤靶点基因Gene Symbol转换成ensembl格式的ID，导入KOBAS 3.0分析平台，获取靶点的生物学注释数据，并利用Omicshare平台将得到的生物过程结果制作成气泡图。

2 结果

2.1 抗肿瘤靶点预测 Z′-score较Fit Score具有更好的统计学意义和置信区间，且Z′-score得分越高说明结合越好[5]，因此，选取Z′-score>0.5为潜在靶点，从PharmMapper分子-靶蛋白对接结果中筛选出103个靶蛋白，通过UniProt数据库将PBD ID转换为Gene Symbol，核对靶蛋白内容选择基因，剔除重复基因，结果共得到102个靶基因。再与Gene Cards数据库挖掘得到5 858个抗肿瘤相关基因进行比对，得到86个Tet抗肿瘤的潜在作用靶点及其在Gene Cards数据库中的肿瘤相关性评分，见表1。

2.2 蛋白相互作用网络构建与分析 把筛选得到与Tet相关的86个抗肿瘤靶蛋白基因，通过STRING数据库获得靶点蛋白相互作用关系，并利用Cytoscape软件进行可视化处理(图2)和Network analyzer[10]分析。在图中，节点表示蛋白和化合物，边表示蛋白之间的关联，其大小反映了靶点蛋白degree的值，节点越大表示该靶点蛋白的degree值越大，表明该节点在网络中越重要。网络拓扑学结构分析显示，该共表达网络聚类相关系数为0.618，网络节点数为83，平均相邻节点数量为11.373，表明Tet抗肿瘤作用具有多靶点属性，且靶蛋白之间具有强烈的相关性。

2.3 分子对接分析 根据上述Network analyzer分析结果，选择靶点中每个靶点的度拓扑参数值大于中位数(degree=9)的2倍作为筛选核心靶点的条件[11]，将其Gene Symbol或PDB ID导入Systems Dock Web Site服务器中，与Tet.sdf格式的3D结构进行对接，进一步确认这11个靶点与Tet的结合活性，见表2。一般认为，docking score>7.0表明药物分子与靶点具有强烈的结合活性，>5.0表明药物分子与靶点具有较好的结合活性，>4.25表明药物分子与靶点具有一定的结合活性。结果表明，Tet的11个核心靶点的docking score>5.0的靶点有8个，表明Tet与ESR1、NOS3、PPARG、ALB、NR3C1、MDM2、LCK、IGF1具有较好的结合活性；Tet与MAPK14、细胞凋亡蛋白酶3(CASP3)具有一定的结合活性；同时，从表1也可发现，11个核心靶点具有很好的抗肿瘤相关性，从而进一步验证了PharmMapper预测靶点的可靠性。

表1 粉防己碱抗肿瘤靶点筛选结果

表2 粉防己碱核心抗肿瘤靶点分子对接结果

2.4 靶蛋白-通路网络特征分析 代谢通路富集分析可以将相似生物学功能靶点聚集形成功能模块，形成生物学功能模块。为进一步阐明Tet的抗肿瘤作用，将预测出的86个抗肿瘤靶点通过KOBAS 3.0进行GO富集和KEGG通路注释分析，利用Omicshare平台进行作图。GO富集分析包括3个分支，即生物过程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和细胞组分(Cellular component)，见图3。其中在生物过程cellular process、metabolic process、single-organism process、response to stimulus、response to regulation靶点富集较集中；在细胞组分中与cell和cell part相关性最大；在分子功能中binding和catalytic activity靶点相对集中富集。通过KEGG生物途径富集分析，识别Tet显著影响的生物途径，其中P<0.05生物通路共有134条，P值最小的前20个的生物途径见图4，节点的颜色与大小由相关联基因的数量和P决定，颜色从绿色到红色反映了P值从大到小，节点从大到小反映了相关联基因的数量从多到少。结果表明，Tet的抗肿瘤活性机制主要涉及肿瘤通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、代谢通路(Metabolic pathways)、胰岛素抵抗(Insulin resistance)、蛋白聚糖肿瘤通路(Proteoglycans in cancer)等信号通路，从而也体现了Tet多途径的作用特点。

图3 粉防己碱抗肿瘤靶蛋白的GO富集分析

图4 粉防己碱KEGG 通路富集分析

3 讨论

本文运用反向分子对接[12]和网络药理学的方法对Tet抗肿瘤作用的潜在靶点和可能作用的机制进行了预测，结果显示，Tet可通过多靶点、多通路发挥抗肿瘤作用，与中药作用成分多靶点、多途径的特性相符。

3.1 Tetrandrine抗肿瘤相关靶基因的研究 对富集的抗肿瘤靶基因进一步分子对接验证分析可知，Tet主要作用于ESR1、NOS3、PPARG、ALB、NR3C1、MDM2、LCK、IGF1等靶蛋白基因，通过共表达网络可以看出，相关靶基因具有一定相关性，进而说明Tet具有多靶点抗肿瘤的潜在活性。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路主要包括细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38 MAPK及BMK1(Big MAP kinase 1)通路。MAPK14，亦称为p38-α，是MAPK信号传导通路中的重要的信号分子，研究发现，Tet可通过激活p38 MAPK信号诱导结肠癌CT-26细胞凋亡，亦可通过抑制ERK磷酸化来增强对A549肺癌细胞的凋亡作用[13-14]。Cui等[15]研究发现，Tet可通过下调细胞凋亡调节器(B2CL1 /BCL2)和激活CASP3发挥抗喉癌干细胞的作用，此抗肿瘤通路也被证实在结肠癌HT-29细胞中[16]，并进行了系统药理学的验证。WU等[17]研究报道，Tet可通过介导下调人胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP-5)的表达，进而使Wnt/β-catenin信号转导失活发挥抗结肠癌细胞的作用，但Tet是否具体作用于IGF1靶点需要进一步验证。Jang[18]研究发现，Tet可通过降低PPARG的表达或磷酸化达到抑制3T3-L1前脂肪细胞脂肪生成的作用，亦可通过降低脂多糖诱导的星形胶质细胞中NOS的mRNA表达水平抑制其活化[19]，但是Tet对PPARG和NOS3在肿瘤通路中的研究未见报道。

ESR1是一种雌激素依赖的转录因子，属于核受体超家族的成员，能够通过与雌激素结合并转移至乳腺癌细胞核中，参与调控基因转录信号通路，进而促进乳腺癌细胞的增殖。目前临床上许多抗癌药物(如来曲唑、依西美坦、他莫昔芬等)的作用机制就是利用和控制这个节点，干扰或阻滞雌激素与雌激素受体的结合，对乳腺癌进行治疗[20-21]。Tet对ESR1靶蛋白的作用，目前尚未见报道。ALB作为血液系统的重要组分，是亲水性的蛋白，可渗入肿瘤组织，却不能进入正常组织，它的这种高的通透性和滞留性被作为抗癌药物载体已有大量研究报道[22-23]。在肿瘤细胞中，肿瘤内皮表达的GP60受体蛋白对ALB有高度的亲和力，GP60参与ALB和相关大分子药物复合物的吸收和分布[24]。Tet虽然具有非常好的生物活性，但是它是亲脂性的，基于PPI网络分析，ALB可作为Tet的药物载体，为深入研究Tet抗肿瘤作用提供了一个很好的思路。NR3C1为细胞核糖皮质激素受体，是一种配体依赖性核转录调控因子，糖皮质激素的生物学效应主要是通过NR3C1 介导，涉及细胞的增殖、分化、凋亡、代谢、迁移及免疫调节等多个方面，对多种类型肿瘤的发生、发展有重要的调节作用[25]。Tet对NR3C1靶蛋白的作用，目前尚未见报道。MDM2 是一种 E3 泛素连接酶，可以使 p53 泛素化并被蛋白酶体降解，MDM2在多种肿瘤细胞中过度表达，不仅能抑制p53的活性，还会导致p53基因突变。近年来小分子MDM2抑制剂(如Idasanutlin、NVP-CGM097和APG-115等)已有多个化合物进入不同阶段的临床研究[26]。因此，阻断MDM2的功能，促使肿瘤细胞凋亡，可作为Tet一个新的抗肿瘤的潜在靶点进行研究。LCK是一种在T细胞和自然杀伤细胞中表达的Src家族的细胞质酪氨酸激酶，其对T细胞的发育、激活和T细胞抗原受体的信号通路都起着重要作用。LCK激酶在细胞中的异位表达可以诱发细胞发生癌变，因此直接选择性抑制LCK可以为T细胞介导的自身免疫性疾病、炎症性疾病、白血病和实体肿瘤等提供良好的治疗[27]。Tet对Lck靶蛋白的作用，目前尚未见报道。

3.2 Tetrandrine相关生物过程和信号通路的研究 肿瘤是一个复杂的过程，涉及到多基因与信号通路。GO生物过程富集分析，发现这些靶点主要富集在细胞过程、代谢过程、刺激应答、催化活性和细胞周期的调控等生物过程，与肿瘤的发生、发展密切相关。结合KEGG基因富集数目和富集因子(图4)可以得知，肿瘤通路、PI3K-Akt信号通路、代谢通路、胰岛素抵抗、蛋白聚糖肿瘤通路等信号通路等是Tet发挥抗肿瘤活性的主要通路。Xu等[28]报道，Tet可通过caspase级联调控、细胞周期阻滞、激活MAPK和抑制PI3K/Akt/mTOR信号途径来诱导糖皮质激素抵抗的人白血病Jurkat T细胞凋亡。Tet通过靶向RAS信号通路的不同效应分子在体内外抑制结肠癌、乳腺癌、胶质瘤和肺癌的生长[2]。Liu等[29]研究发现，Tet通过激活caspase级联和抑制PI3K/Akt信号通路，对前列腺癌DU145和PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭有较强的抑制作用。武建毅等[30]研究发现，Tet可抑制Akt和NF-κB信号通路诱导人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡，此通路的抑制也可明显诱导肺癌细胞A549的凋亡[31]。总之，虽有一些通路未被实验证实，但大量研究[2,32]仍提示Tet在肿瘤治疗中有很好的应用前景。

综上所述，这些靶基因参与了多种肿瘤通路，对于判断肿瘤发展过程和治疗效果预测，降低复发率和死亡率，延长生存期都具有重要意义，如在甲状腺癌患者中ESR1的高表达提示有不良的总生存周期[33]；IGF-IR表达阴性的结直肠癌患者的累积生存率和平均生存时间均显著高于IGF-IR表达阳性的结直肠癌患者[34]。因此，本文通过反向对接的方法对Tet抗肿瘤的潜在的人源靶蛋白进行了虚拟筛选研究，并进一步探讨了潜在靶蛋白的蛋白互作网络及其KEGG通路研究，结果显示所得预测的部分潜在抗肿瘤靶点和通路已有相关文献报道，在一定程度上确证了本研究有关网络药理学预测的准确性，预测的一些新靶标和通路为进一步的实验研究指引了新方向，也为以Tet为基础的创新抗肿瘤药物研制奠定了基础。