miR-21靶向调控PDCD4对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

曾 磊，王美燕，付学峰

0 引言

皮肤鳞状细胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)是我国最常见的皮肤恶性肿瘤之一，起源于表层皮肤或皮肤附属器角质形成细胞，多发于面部、耳部、手背等见光部位[1-2]。cSCC发病机制较为复杂，是多种因素逐步影响、综合作用的结果，暂无有效治疗措施。因此,研究cSCC发病的分子机制，寻求有效并可靠的靶向治疗目标，是当前cSCC基因治疗的热点[3]。研究表明，与正常皮肤细胞相比，cSCC细胞中的基因转录水平和模式均存在差异，而细胞内的非编码RNA在基因表达调控、细胞发育等过程中发挥重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类具有调控功能的非编码RNA，存在于多种生物基因组中，参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种过程[5]。miR-21可看作一种致癌基因，在多种肿瘤组织中表达异常，调控肿瘤发生发展、演变进程等，近年研究发现，在cSCC中同样存在miR-21的异常表达[6-7]。程序性细胞死亡因子4(Programmed cell death 4,PDCD4)是一种抑癌基因，在人脑、肝、肺、胃、皮肤等多种组织中均有表达，而在结直肠癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤组织中则存在PDCD4的低表达甚至缺失，且与肿瘤的演变进程、恶性程度和预后生存密切相关[8-9]。在cSCC中PDCD4表达下降，但其对cSCC细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学行为中的影响尚无定论[10]。本研究通过探讨miR-21和PDCD4对cSCC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学行为的影响，以期为cSCC的诊疗提供有效的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 人正常皮肤细胞HaCaT及人皮肤鳞状细胞癌细胞A431、HSC-5、SCL-1 购于上海生命科学研究所；逆转录PCR试剂盒、Trizol试剂盒、蛋白提取试剂盒均购于德国QIAGEN公司；Lipofectamine TM 2000转染试剂、荧光素酶试剂盒均购于美国vector公司；MTT试剂盒、Transwell试剂盒、Western blot试剂盒购自美国BD公司；miR模拟物(miR-21 mimic)及阴性对照(miR-NC)、miR抑制剂(miR-21 inhibitor)及阴性对照(miR-NC)、PDCD4过表达载体(OE-PDCD4)及阴性对照(OE-NC)、PDCD4干扰载体(si-PDCD4)及阴性对照(si-NC)、miR-21和U6引物均购于上海吉玛有限公司；野生型(WT)和突变型(MUT)PDCD4质粒由上海生工生物公司合成；PDCD4抗体及相应二抗均购于美国Sigma公司。

1.2 研究方法 细胞培养：取出冻存在液氮罐中的HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1细胞株，37 ℃水浴解冻，以DMEM培养基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、95%湿度、5%CO2恒温箱中培养，定期换液。

1.2.1 PCR检测miR-21的表达 取对数生长期HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1细胞，Trizol法提取细胞总RNA，按照逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒说明书，以相应的反转录引物进行逆转录反应，条件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min，最后80 ℃ 5 min。采用实时定量PCR进行扩增，95 ℃ 5 min预变性，然后90 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min，共进行40个循环。实验操作严格按照相应试剂盒说明书进行，miR-21和U6引物见表1。miR-21的表达水平采用等式2-△△CT法分析，△△CT=△CT实验组-△CT对照组；△CT实验组=CT目标基因，实验组-CT内参基因，实验组；△CT对照组=CT目标基因，对照组-CT内参基因，对照组；2-△△CT表示观察组相对于对照组miR-21的表达倍数。

表1 miR-21和U6 PCR引物序列

1.2.2 细胞转染 取对数期A431细胞接种于6孔培养板中，将细胞分为空载体对照组(Control)、miR-21抑制剂组(miR-21 inhibitor)和阴性对照组(miR-NC)。待细胞生长至融合度达80%以上时，转染按照Lipofectamine TM 2000操作说明将空载体、miR-21 inhibitor、miR-NC、OE-PDCD4、OE-NC、si-PDCD4、si-NC分别转染至A431、SCL-1细胞中，37℃、95%湿度、5%CO2恒温箱中培养。

1.2.3 Western blot检测PDCD4表达 收集各组细胞，按照总蛋白提取试剂盒说明书操作提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质量。取蛋白样品进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，脱脂奶粉封闭，加入一抗PDCD4(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，暗室显影，采用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带吸光度，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复3次。

1.2.4 MTT实验 细胞转染24 h后接种于96孔板，调整细胞浓度为5×103个/孔，继续培养。于培养0 h、24 h、48 h、72 h时加入20 μl(5 mg/mL)MTT溶液，孵育3 h，弃上清，添加150 μl DMSO。微孔板分光光度计检测490 nm处的吸光度。

1.2.5 细胞划痕实验 取对数生长期细胞接种于6孔板，调整细胞浓度至2×105个/孔，待细胞生长至80～90%融合度时，用移液枪在细胞单层中划出伤口，继续培养48 h，观察伤口愈合情况。实验重复3次。

1.2.6 Transwell小室实验 实验前弃去原细胞培养液，更换成无血清培养基，胰蛋白酶消化细胞，取5×105个细胞重悬。取40 μl Matrigel基质胶铺于Transwell小室，待胶凝固后，取200～250 μl细胞悬液至Transwell小室，下层加入500 μl完全培养基，37 ℃、5%CO2培养24 h，4%甲醛固定，0.1%结晶紫染液避光染色，清洗晾干后倒置荧光显微镜下观察。实验重复3次。

1.2.7 流式细胞术 转染后的细胞在1 500 r/min下离心5 min，收集细胞，PBS洗涤。加入5 μl的7AAD和PE标记的Annexin V。流式细胞仪测定细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.8 荧光素酶实验 构建含有PDCD4 3′UTR结合位点的pGL3-PDCD4-WT野生型荧光素酶报告载体和不含PDCD4 3′UTR结合位点的pGL3-PDCD4-MUT突变型荧光素酶报告载体，将pGL3-PDCD4-WT、pGL3-PDCD4-MUT分别与miR-21 mimics、miR-NC共转染至A431细胞中，24 h后检测荧光素酶活性，计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值。

2 结果

2.1 4种皮肤细胞中miR-21和PDCD4表达比较 通过qRT-PCR检测各组细胞miR-21表达、Western blot检测各组细胞PDCD4表达，其中miR-21以U6为内参、PDCD4以GAPDH为内参。结果显示，与正常皮肤细胞HaCaT相比，A431、HSC-5、SCL-1细胞中miR-21表达均上升，PDCD4表达均下降，以A431、SCL-1细胞变化最为显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。因此，选择细胞株A431、SCL-1进行后续试验。

图1 4种皮肤细胞中miR-21和PDCD4表达比较注：A.HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1 4种细胞miR-21表达比较；B.HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1 4种细胞PDCD4表达比较。*与HaCaT相比，P<0.05

2.2 miR-21和PDCD4靶向关系的预测和验证 生物信息学软件预测发现，miR-21与PDCD4存在特异性结合位点(见图2)。荧光素酶实验发现，PDCD4-WT与miR-21 mimics共转染A431细胞后，细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，而PDCD4-MUT与miR-21 mimics共转染A431细胞后，细胞荧光素酶活性无变化(P>0.05)，说明PDCD4是miR-21的靶基因(见图3)。

图2 miR-21与PDCD4结合位点

图3 荧光素酶实验验证miR-21与PDCD4之间的靶向关系注：与miR-NC相比，*P<0.05

2.3 转染miR-21 inhibitor后A431细胞中miR-21和PDCD4表达 通过qRT-PCR检测各组A431和SCL-1细胞中miR-21表达、Western blot检测各组细胞PDCD4表达，其中miR-21以U6为内参、PDCD4以GAPDH为内参。结果显示，miR-NC、OE-NC与Control组miR-21、PDCD4表达差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组相比，miR-21 inhibitor组miR-21表达下降，PDCD4表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。与OE-NC组相比，OE-PDCD4组miR-21表达不变，PDCD4表达增加(P<0.05)。见图4。

图4 各组A431、SCL-1细胞中miR-21和PDCD4表达情况注：A.各组A431细胞中miR-21表达情况；B.各组A431细胞中PDCD4表达情况；C.各组SCL-1细胞中miR-21表达情况；D.各组SCL-1细胞中PDCD4表达情况。*与miR-NC组相比，P<0.05；#与OE-NC组相比，P<0.05

2.4 miR-21靶向调控PDCD4表达对A431细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，A431和SCL-1细胞中，miR-NC、OE-NC与Control组细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组相比，miR-21 inhibitor组第24小时、48小时、72小时的细胞活力下降；差异均有统计学意义(P<0.05)。与OE-NC组相比，OE-PDCD4组第24小时、48小时、72小时的细胞活力下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 miR-21靶向调控PDCD4表达对A431、SCL-1细胞增殖的影响注：A.各组A431细胞活力比较；B.各组SCL-1细胞活力比较。*与miR-NC组相比，P<0.05；#与OE-NC组相比，P<0.05

2.5 miR-21靶向调控PDCD4表达对A431细胞迁移、侵袭的影响 细胞划痕和Transwell实验结果显示，A431和SCL-1细胞中，miR-NC、OE-NC与Control组伤口愈合百分比、侵袭细胞数目比较差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组相比，miR-21 inhibitor组伤口愈合百分比和侵袭细胞数目均减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。与OE-NC组相比，OE-PDCD4组伤口愈合百分比和侵袭细胞数目均减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 miR-21靶向调控PDCD4表达对A431、SCL-1细胞迁移、侵袭的影响注：A.细胞划痕实验检测A431、SCL-1细胞中miR-21 inhibitor对细胞迁移能力的影响(400×)B.各组细胞伤口愈合百分比比较；C.Transwell检测A431、SCL-1细胞中miR-21 inhibitor对细胞侵袭能力的影响(400×)；D.各组细胞侵袭数目比较。*与miR-NC组相比，P<0.05；#与OE-NC组相比，P<0.05

2.6 miR-21靶向调控PDCD4表达对A431细胞凋亡的影响 流式细胞术实验结果显示，A431和SCL-1细胞中，miR-NC、OE-NC与Control组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组相比，miR-21 inhibitor组细胞凋亡率上升，差异有统计学意义(P<0.05)。与OE-NC组相比，OE-PDCD4组细胞凋亡率上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。

2.7 干扰PDCD4对A431、SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 结果显示，干扰PDCD4表达后，A431、SCL-1细胞中PDCD4表达下降(图7A)，24 h、48 h、72 h的OD值均上升，伤口愈合百分比、细胞侵袭数目均上升，细胞凋亡率下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图8。

图7 miR-21靶向调控PDCD4表达对A431、SCL-1细胞凋亡的影响注：A.流式细胞术检测A431、SCL-1细胞中miR-21 inhibitor对细胞凋亡的影响；B.各组细胞凋亡率比较。*与miR-NC组相比，P<0.05；#与OE-NC组相比，P<0.05

图8 干扰PDCD4对A431、SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响注：A.干扰PDCD4表达后A431、SCL-1细胞中PDCD4表达情况；B.干扰PDCD4后A431、SCL-1细胞增殖变化；C.干扰PDCD4后A431、SCL-1细胞迁移变化(400×)；D.干扰PDCD4后A431、SCL-1细胞侵袭变化(400×)；E.干扰PDCD4后A431、SCL-1细胞凋亡变化。*与si-NC相比，P<0.05

3 讨论

cSCC是一种常见的皮肤恶性肿瘤，严重影响患者生活质量和预后生存，多发于老年群体，尤以50～60岁老年患者最为常见。cSCC好发于皮肤暴露部位，早期表现为浸润性斑块，且具有复发和远处转移等特征，但其具体发病机制尚不清[11-12]。近年来生物学分析发现，cSCC的发展是一个多基因、多因素、多阶段影响的过程，其发生发展机制涉及多种信号通路[13]。因此，从分子生物学角度出发寻找靶向治疗cSCC的标志物，有望为患者提供一种可靠的治疗方法。

miRNA是一种约由18～24个核苷酸组成的非编码RNA，可与其靶基因mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)特异性结合位点结合，导致靶基因mRNA的降解或抑制其翻译过程，从而实现对基因的靶向调控，影响细胞的增殖、迁移和凋亡等过程[14-15]。目前认为，miRNA在机体中发挥癌基因或抑癌基因的作用，参与调控肿瘤的发生、转移、浸润和血管新生等过程[16]。miR-21是一种典型的癌基因，可通过JAK/STAT信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、RaS/MAPK信号通路及PI3K/AKT信号通路等多个细胞信号传导途径参与多种实体肿瘤的发生和发展，几乎在所有上皮源性的恶性实体肿瘤中都存在miR-21的高表达[17-18]。抑制或敲除miR-21的表达能够抑制肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞的生长和迁移，并促进肿瘤细胞发生凋亡，对抗肿瘤治疗具有重要意义[19]。在本研究中，miR-21在cSCC细胞株中均呈高表达，提示在cSCC中miR-21同样存在致癌作用。转染miR-21 inhibitor后，A431细胞在24 h、48 h、72 h时的增殖能力显著下降，表明抑制miR-21表达后可有效抑制A431细胞的增殖。经细胞划痕和Transwell实验，发现下调miR-21表达后，伤口愈合百分比和细胞侵袭数目下降，即细胞迁移和侵袭能力受到抑制。流式细胞术检测A431细胞凋亡发现，抑制miR-21的表达能增强肿瘤细胞凋亡能力。表明miR-21有可能作为治疗cSCC的有效靶标。

PDCD4是一种在进化上高度保守的抑癌基因，正常表达于多种组织和器官中，但在肿瘤细胞中呈低表达甚至不表达[20]。在宫颈癌的研究中发现，PDCD4能够抑制宫颈癌细胞的恶性行为学活动[21]。对乳腺癌的研究发现，PDCD4在其癌组织中低表达，同时miR-21呈高表达，miR-21的过表达能够抑制PDCD4，从而参与乳腺癌的发生[22]。本研究结果中，各cSCC细胞中，PDCD4呈低表达。过表达后，发现A431、SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭能力显著下降，而细胞凋亡率明显上升。而干扰PDCD4表达后，A431、SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭能力显著上升，而细胞凋亡率明显下降。这可能与PDCD4进一步调控其下游信号通路相关。此外，通过生物信息学软件发现，miR-21与PDCD4存在特异性结合位点，而荧光素酶实验进一步证明miR-21可靶向负调控PDCD4表达。

综上所述，cSCC细胞中均存在miR-21的高表达和PDCD4的低表达，且miR-21能够靶向负调控PDCD4表达，抑制miR-21表达后，cSCC细胞的增殖、迁移、侵袭能力均下降，细胞凋亡率上升，其作用可能与miR-21表达下降后PDCD4表达上升有关。