基于HPLC-QAMS法对清热通淋丸中7种成分的质量控制研究

刘德军，贺 玲，樊苗苗，陶弘武，王艳荣

0 引言

清热通淋丸由爵床、苦参、白茅根、硼砂4味药材按照中医理论配伍而成，主要用于下焦湿热所致热淋以及急性下尿路泌尿系感染所致小便频急、尿道刺痛、尿液混浊、口干苦等的治疗。清热通淋丸方中苦参清热、燥湿、利尿，为其君药；爵床清热解毒、和中化湿，白茅根清热利尿，硼砂清热解毒，诸药合用，共达清热、利湿、通淋的临床功效。苦参为豆科槐属植物苦参的干燥根，主要含有生物碱和黄酮类成分，具有清热、燥湿、利尿的功效，苦参醇I、苦参酮和槐属二氢黄酮G等异戊烯基黄酮类以及三叶豆紫檀苷、高丽槐素等紫檀素类为其黄酮类代表性成分；爵床为爵床科植物爵床的干燥全草，主要含有木脂素及其苷类等化学成分，其中6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B等为其木脂素类代表性成分。中药及其制剂所含组分复杂，现行质量标准和文献报道[1]仅对方中苦参所含苦参碱和氧化苦参碱进行质量控制研究，而苦参同属近缘药材如山豆根等药材中也含有苦参碱和氧化苦参碱等成分，专属性不强。单一成分难以全面评价中成药复方制剂的整体质量，多指标成分含量测定的质量评价模式越来越被推广和认可，因此，笔者采用高效液相一测多评法[2]，对清热通淋丸中三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的含量进行同时测定，旨在更加全面地评价清热通淋丸的产品质量，为进一步完善清热通淋丸的质量标准提供试验参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪，配备SPD-10Avp plus可变波长检测器(日本岛津公司)，Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；BT25S型电子天平(赛多利斯公司)；Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 试药 三叶豆紫檀苷对照品(批号：PRF8041446，CAS号：6807-83-6，含量：99.4%)和苦参醇I对照品(批号：PRF8032701，CAS号：99119-69-4，含量：98.0%)均来源于成都普瑞法科技开发有限公司；苦参酮对照品(批号：18060822，CAS号：34981-26-5，含量：97.7%)、槐属二氢黄酮G对照品(批号：18060622，CAS号：34981-24-3，含量：99.7%)、6′-羟基爵床脂素B对照品(批号：17062622，CAS号：145726-39-2，含量：98.0%)和6′-羟基爵床脂素A对照品(批号：17030623，CAS号：145971-08-0，含量：95.0%)均来源于上海同田生物技术股份有限公司；爵床脂素B对照品(批号：18062021，CAS号：17951-19-8，含量：98.0%)来源于上海双福生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；清热通淋丸(规格：每丸重0.16 g，批号：190201、190303、190603)来源于吉林省通化博祥药业股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 单组分对照品母液和混合对照品溶液的制备 精密称取三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B对照品适量，用甲醇分别制成0.182、0.378、1.134、0.258、0.296、0.512、0.818 mg/ml的7种单组分对照品母液。精密吸取7种单组分对照品母液各2.5 ml，用甲醇制成三叶豆紫檀苷9.1 μg/ml、苦参醇I18.9 μg/ml、苦参酮56.7 μg/ml、槐属二氢黄酮G 12.9 μg/ml、6′-羟基爵床脂素B 14.8 μg/ml、6′-羟基爵床脂素A 25.6 μg/ml 和爵床脂素B 40.9 μg/ml的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液和阴性样品溶液的制备 取清热通淋丸20粒，研细，取1.0 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，称重，加热回流提取60 min，放冷，用甲醇补重，0.45 μm微孔滤膜过滤，制成清热通淋丸供试品溶液。依据国家药品标准YBZ05982009中清热通淋丸的工艺处方分别制备缺苦参、缺爵床的2种阴性样品，再按上述方法分别制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验 以Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱；乙腈(A)-水(B)为流动相进行梯度洗脱(0～9.0 min，35.0%A；9.0～21.0 min，35.0%A→42.0%A；21.0～39.0 min，42.0%A→58.0%A；39.0～45.0 min，58.0%A→35.0%A)；波长切换：0～21.0 min在295 nm波长处检测三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮和槐属二氢黄酮G[3]，21.0～45.0 min在256 nm波长处检测6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B[4-5]；流速为1.0 ml/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μl。在上述色谱条件下，精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液以及“2.1.2”项下各溶液分别依法进样检测，测定结果见图1。结果表明，7种待测成分三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B与相邻杂质峰均能达到有效分离，分离度均>1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计均≥4 500，阴性样品对清热通淋丸中三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的定量测定无干扰。

图1 混合对照品(A)、清热通淋丸(B)、苦参阴性样品(C)和爵床阴性样品(D)的HPLC色谱图注：1.三叶豆紫檀苷，2.苦参醇I，3.苦参酮，4.槐属二氢黄酮G，5.6′-羟基爵床脂素B，6.6′-羟基爵床脂素A，7.爵床脂素B

2.3 标准曲线的测定 分别精密吸取“2.1.1”项下7种单组分对照品母液适量，用甲醇分别制成三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B 25倍质量浓度差的6个系列混合对照品溶液，在上述色谱条件下进行检测，记录各成分色谱峰峰面积，以三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1 7种成分线性关系和线性范围

2.4 精密度、重复性、稳定性试验 取“2.1”项下混合对照品溶液重复进样6次，测得三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B峰面积的RSD分别为1.13%、0.96%、0.52%、1.08%、1.01%、0.81%和0.68%，表明该仪器精密度良好。取同一批次清热通淋丸样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，依法进样检测三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面积，计算得7种待测成分含量的RSD分别为1.85%、1.59%、0.92%、1.74%、1.68%、1.47%和1.30%，表明该方法重复性良好。临用新配1份清热通淋丸供试品溶液，于0、2、4、6、12、18和24 h依法进样检测三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面积，结果清热通淋丸供试品溶液24 h内稳定，7种待测成分峰面积的RSD分别为1.09%、0.94%、0.55%、1.11%、1.03%、0.79%和0.67%。

2.5 加样回收率试验 取三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B含量已知的同一批次清热通淋丸样品适量，研成细粉，取9份，每份0.5 g，精密称定，随机分成3组，按照中国药典2015年版四部规定要求，分别精密加入混合对照品溶液(三叶豆紫檀苷0.065 mg/ml、苦参醇I 0.143 mg/ml、苦参酮0.407 mg/ml、槐属二氢黄酮G 0.099 mg/ml、6′-羟基爵床脂素B 0.107 mg/ml、6′-羟基爵床脂素A 0.171 mg/ml和爵床脂素B 0.278 mg/ml)1.0、2.0和3.0 ml各一组，再按“2.1.2”项下方法制成加样供试品溶液，依法进样测定三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面积，计算7种待测成分的加样回收率，结果表明，所测成分三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的平均加样回收率及RSD分别为97.99%(1.42%)、98.44%(0.85%)、99.47%(0.92%)、96.98%(1.21%)、99.50%(0.74%)、100.00%(1.04%)和98.39%(1.32%)。

2.6 相对校正因子的测定 精密吸取“2.3”项下6个系列混合对照品溶液依法进样测定，记录三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面积，以苦参酮为内参物，按计算公式：fk/s=fk/fs=(XkYs)/(XsYk)(式中X为质量浓度，Y为峰面积，k为内参物，s为其他待测成分)分别计算三叶豆紫檀苷、苦参醇I、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的相对校正因子，结果见表2。

表2 各成分的相对校正因子

2.7 相对校正因子耐用性考察

2.7.1 不同仪器、不同色谱柱 精密吸取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，依法进样测定三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面积，对比考察Shimazu LC-20AT型、Agilent 1260型高效液相色谱仪和Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表3。

表3 不同仪器、不同色谱柱对相对校正因子的影响

2.7.2 不同流速 精密吸取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，依法进样测定三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面积，对比考察不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 ml/min)对相对校正因子的影响，结果见表4。

表4 不同流速对相对校正因子的影响

2.7.3 不同柱温 精密吸取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，依法进样测定三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面积，对比考察不同柱温(28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃)对相对校正因子的影响，结果见表5。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响

2.8 待测组分色谱峰的定位 精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液，依法进样测定，记录三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B色谱峰的保留时间，采用相对保留时间值法(各待测成分与内参物苦参酮色谱峰保留时间的比值)对待测成分色谱峰进行定位，结果见表6。

表6 各成分的相对保留时间值

2.9 一测多评法(QAMS)与外标法(ESM)测定结果比较 取清热通淋丸样品3批，按“2.2”项下方法制备清热通淋丸样品溶液，在上述色谱条件下，进行检测，记录色谱图，采用外标法和一测多评法分别计算三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的含量。测定结果见表7。

表7 各成分含量测定结果 (mg/g)

3 讨论

3.1 供试品提取方式的确定 本试验在确定供试品制备方法时，首先对不同提取溶剂(95%乙醇[6]、甲醇[7-8]、50%甲醇)进行对比考察，以清热通淋丸中待测成分三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的综合提取率为主要指标，同时兼顾杂质峰数量，结果显示，以甲醇为提取溶剂时，待测目标成分综合提取率最佳，杂质成分干扰较少；其次对不同提取方式(超声提取法[7-8]、加热回流提取法[5-6])进行对比，结果显示，两种提取方法下待测成分6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的提取效果差异不大，但三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G的提取效果加热回流提取明显优于超声提取结果，可能与清热通淋丸中三分之二处方量苦参细粉直接入药有关，最后通过对提取时间的不断优化，最终确定以甲醇加热回流提取60 min作为清热通淋丸供试品溶液的制备方法。

3.2 检测波长的确定 采用二极管阵列检测器在190～400 nm下对待测成分对照品溶液进行全波长扫描，结果三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮和槐属二氢黄酮G在280 nm和295 nm波长处有较大吸收，但295 nm波长处的响应值较大，灵敏度高；6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B在256 nm和303 nm波长处有较大吸收，但256 nm处响应值较大，故最终确定在295 nm波长处检测三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮和槐属二氢黄酮G，在256 nm波长处检测6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B。

3.3 色谱条件流动相的选择 本试验参考相关文献对比考察了乙腈-水[3-6]、甲醇-水[7-9]两个流动相系统。以清热通淋丸中待测成分三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B的分离效果为主要指标，同时兼顾色谱图基线平稳情况以及分析检测时间等因素。结果显示，乙腈-水流动相系统优于甲醇-水体系，同时对流动相比例进行不断摸索，最终确定采用乙腈-水为流动相按照正文中洗脱程序对清热通淋丸中待测成分三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B含量进行同时测定。

3.4 目标测定成分的选择 清热通淋丸由爵床、苦参、白茅根、硼砂4味中药材加工而来，在试验过程中，笔者曾尝试对方中药味白茅根所含主要成分进行定量测定，结果清热通淋丸中所含香草酸、对羟基肉桂酸等成分含量极低，不宜作为定量控制指标成分，故最终选取爵床所含代表性成分6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B，苦参所含主要有效成分三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮和槐属二氢黄酮G为定量测定目标成分。

4 结论

本试验首次采用一测多评法对清热通淋丸中三叶豆紫檀苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、6′-羟基爵床脂素B、6′-羟基爵床脂素A和爵床脂素B含量进行同时测定，建立了清热通淋丸多指标质量控制模式，所建立的方法操作便捷、结果准确、重复性好，较传统的多指标成分质量控制模式降低了检验成本，为全面评价清热通淋丸的内在产品质量，确保产品质量的稳定性和临床疗效的一致性提供了试验数据支持。