罗哌卡因对新生大鼠脑细胞凋亡以及学习能力的影响

李前辉，谢小娟，张宜林

我国每年有大量的婴幼儿会接受麻醉及手术，麻醉及手术创伤对婴幼儿的影响一直是医院和家长关注的问题。诸多的临床研究以及实验动物研究显示患者在术后及麻醉后出现认知性的障碍均与麻醉药物存在相关性[1-2]。麻醉药物是目前公认的能引起患者出现短时间认知障碍的药物[3]。罗哌卡因是临床常用的局部麻醉药物之一，被广泛应用于各种麻醉，特别是剖宫产和婴幼儿小手术中[4-6]。罗哌卡因作为一种局部麻醉药物，是否会对婴幼儿认知造成影响，目前报道较少。该研究以新生大鼠作为研究对象，分析了罗哌卡因对新生大鼠学习认知能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物120只出生10 d的新生大鼠购自上海斯莱克生物有限公司，动物批准号：12910371116，大鼠饲养于SPF动物房。

1.2 实验材料TNF-α和IL-1β细胞因子试剂盒购自美国R&D公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自南京诺唯赞生物有限公司；2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix购自南京诺唯赞生物有限公司；Bcl-2、Bax和Caspase-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自北京中山金桥生物有限公司；TUNEL染色试剂盒购自南京诺唯赞生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 实验分组与处理60只出生10 d的新生大鼠随机分为3组，每组20只，即对照组、低剂量组和高剂量组。低剂量组和高剂量组分别采用微量注射器经腹腔给予0.5%的罗哌卡因20 μl和60 μl，对照组注射60 μl的生理盐水。在处理12 h后，60只新生大鼠全部处死，取血液和脑组织，进行后续指标检测。另取60只出生10 d的新生大鼠如上处理后29 d，采用水平迷宫实验分析学习记忆能力。

1.4 荧光定量PCR分析炎症因子mRNA水平取脑组织0.1 g，匀浆后采用RNA提取试剂盒提取总RNA，并采用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，作为PCR模板。然后根据根据PSAT1基因的序列，设计如下引物：PSAT1：(F:5′-GGCCAGTTCAGTGCTGTCC-3′；R:5′-GCTCCTGTCACCACATAGTCA-3′)、GAPDH:(F:5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′；R:5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′)。制备RT-PCR体系：2×qPCR SYBR Green Mix 10 μl, 上游和下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，用水将体积补至20 μl。按照以下反应条件进行PCR：93 ℃, 3 min预变性；93 ℃,30 s变性；55 ℃,45 s退火延伸；72 ℃延伸45 s，共40个循环。最后从实时荧光定量PCR仪上直接读取数据，进行定量分析。

1.5 ELISA法检测血清炎症因子的水平新生大鼠在处理12 h后，取血液，在4 ℃静置12 h，使血清分层，然后3 000 r/min离心5 min，收集血清。然后按照ELISA试剂盒操作说明书测定TNF-α和IL-1β的水平。

1.6 Western blot分析脑组织凋亡相关蛋白的表达取脑组织0.5 g，加入细胞裂解液，匀浆后，12 000 r/min离心20 min，然后将上清转移至新的离心管，20 000 g离心1 h，收集细胞裂解上清，加入5×Loading buffer,在金属浴中煮沸20 min, 然后进行SDS-PAGE，起始电压80 V。待溴酚蓝进入分离胶，将电压调至120 V。电泳结束后将蛋白转移至NC膜上，NC膜用5%脱脂奶粉封闭30 min，结束后分别用5%脱脂奶粉稀释Bcl-2、Bax、Caspase-3单克隆抗体，在4 ℃孵育12 h，结束后用PBST洗涤3次，每次5 min；再用5%脱脂奶粉稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，在室温孵育30 min，然后PBST洗涤3次后，NC膜上滴加发光液后进行扫描，分析蛋白条带变化，并以β-actin作为内参。

1.7 TUNEL检测脑组织细胞凋亡水平将各组大鼠脑组织切成3～5 μm的石蜡切片；将切片用二甲苯浸洗脱蜡，共2次，每次5 min；分别用100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗水化，每次3 min；3%过氧化氢溶液室温孵育10 min；TBS浸洗5 min；滴加Proteinase K溶液(浓度为20 μg/ml)，室温孵育15 min；TBS浸洗5 min；配制TUNEL反应混合物，滴加100 μl TUNEL反应混合物，置于湿盒中，37 ℃避光孵育60 min；TBS浸洗2次，每次5 min；倒置荧光显微镜下进行观察，观察时采用40倍物镜和10倍目镜，随机选取梗死区和周边区域10个视野，计算凋亡细胞占总细胞的比例作为脑细胞的凋亡指数。

1.8 Morris水平迷宫实验水平迷宫实验方法按Wen et al[6]方法进行。主要测定不同处理大鼠平均逃避潜伏期，原平台象限活动时间和穿越原平台次数。

2 结果

2.1 罗哌卡因对新生大鼠炎症因子的影响与对照组比较，罗哌卡因低剂量组和高剂量组大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β mRNA及血清中TNF-α和IL-1β 蛋白质水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组比较，高剂量组大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β mRNA及血清中TNF-α和IL-1β 蛋白质水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 罗哌卡因对新生大鼠炎症因子水平的影响

2.2 罗哌卡因对新生大鼠脑组织凋亡相关蛋白的影响与对照组比较，罗哌卡因低剂量组和高剂量组大鼠脑组织中凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白水平明显增加，抗凋亡蛋白Bcl-2水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组比较，高剂量组大鼠脑组织中凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白水平增加更为显著，抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 罗哌卡因对新生大鼠脑组织凋亡相关蛋白的影响

2.3 罗哌卡因对新生大鼠脑组织凋亡水平影响与对照组比较，罗哌卡因低剂量组和高剂量组大鼠脑组织细胞凋亡水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组比较，高剂量组大鼠脑组织细胞凋亡水平增加更为显著，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 罗哌卡因对新生大鼠脑组织细胞凋亡水平的影响

2.4 罗哌卡因对新生大鼠学习记忆能力的影响与对照组比较，在第29～32天，低剂量组和高剂量组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，其中第31天和第32天，高剂量组逃避潜伏期高于低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组探索实验中原平台象限活动时间和穿越平台次数差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、3。

表2 罗哌卡因对新生大鼠逃避潜伏期的影响

表3 罗哌卡因对小鼠探索能力的影响

3 讨论

罗哌卡因是单一对映结构体长效酰胺类局麻药，其作用机制与其它局麻药相似，通过抑制神经细胞钠离子通道，阻断神经兴奋与传导[7]。罗哌卡因被广泛应用于硬膜外麻醉如剖宫产术或者儿科手术，或者用于术后及分娩镇痛等过程中[8-9]。但其是否会对分娩时胎儿或者婴幼儿造成一定的不良反应，目前报道很少。认知障碍是麻醉类药物常见的不良反应。认知是机体认识和获取知识的智能加工过程，它包括学习、记忆、语言、思维、精神、情感等一系列的心理和社会行为[10-11]。目前对于麻醉药物对认知的影响说法不一，有研究显示麻醉药物可以提高患者的认知能力，有研究显示麻醉药物可降低患者的认知能力。本研究在动物水平上分析了罗哌卡因对大鼠学习认知能力的影响。

为了模拟胎儿或者婴幼儿，本研究选用出生后第7天大鼠作为研究模型。出生后第7天是啮齿类动物大脑神经细胞发育的高峰时期，是研究药物对神经系统影响的最佳时期[12]。Morris水迷宫实验被广泛用于实验动物的学习记忆能力分析[13]。本研究结果显示，与对照组比较，低剂量组和高剂量组大鼠逃避潜伏期明显延长，其中第31天和第32天，高剂量组逃避潜伏期高于低剂量组，说明罗哌卡因处理大鼠后会影响大鼠的学习记忆能力，并随着药物剂量增加，影响水平也逐渐增强。在探索实验中，研究结果显示，罗哌卡因对原平台象限活动时间和穿越平台次数无影响，说明罗哌卡因对大鼠探索能力无影响。

在罗哌卡因处理大鼠后，可见大鼠炎症因子的水平明显增加，说明罗哌卡因可以诱导机体出现炎症反应。同时罗哌卡因导致脑组织细胞凋亡相关蛋白的表达水平上调，细胞凋亡比例明显增加。上述结果说明罗哌卡因可以导致炎症，并诱发细胞凋亡。值得注意的是，罗哌卡因对细胞炎症和凋亡的影响相对较弱，但是对于新生大鼠而言，轻微的炎症或者凋亡可能导致神经元损伤，神经元不具有增殖能力，一旦损伤可能会明显降低信息传递的能力。

综上所述，罗哌卡因对新生大鼠脑组织可产生炎症反应，并诱导细胞凋亡，进而影响大鼠的学习和记忆能力。