海洋假交替单胞菌产胞外活性氧特性研究

郭 定 环， 王 竞， 顾 晨， 郭 雅 丽

( 大连理工大学 环境学院, 辽宁 大连 116024 )

0 引 言

目前仅仅发现了无光环境中细菌产生胞外ROS的现象，但黑暗条件下细菌形成胞外ROS的影响因素、反应条件和动力学特性等研究则未见报道.基于此，本文开展无光条件下海洋Pseudoalteromonassp. GCY产胞外ROS特性研究.

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

1.2 实验方法

表1 OPs的浓度范围

1.2.3 酶活性测定 测定菌株生长期内，胞外过氧化氢酶(catalase，CAT)活性和LAAO活性.向胞外液中加入等量、足量的H2O2，使终浓度约为100 μmol/L，定义25 ℃、避光条件下，1 h去除100 μmol/L H2O2的CAT活性为100%；向胞外液中添加足量L-亮氨酸，使终浓度为5 mmol/L，定义1 h内增加5 μmol/L的H2O2时LAAO酶活性A为100%[20].

1.3 分析方法

生物量用D(600 nm)表示，用紫外-可见分光光度计(光谱仪器SP-756P)测定；H2O2测定采用N，N-二乙基对苯二胺/辣根过氧化物酶法[21]；数据处理和图像绘制采用Origin软件.

2 结果与讨论

2.1 基质对ROS胞外形成特性的影响

不同基质、不同浓度条件下，菌株GCY生长情况和产胞外H2O2存在差异(图1)，6 g/L浓度的基质能基本满足菌株生长需要，对数期没有检出H2O2，稳定期H2O2浓度逐渐升高.综合考虑菌株胞外H2O2浓度和生物量情况，选取6 g/L的蛋白胨和牛肉膏进行后续研究.在6 g/L的蛋白胨和牛肉膏体系中，虽然菌体生物量基本一致，H2O2的浓度变化趋势也相同，但是，两体系中H2O2的浓度存在较大差别，其中，蛋白胨体系中H2O2的最大浓度为(1.5±0.1) μmol/L，而牛肉膏中达到(8.1±0.6) μmol/L.综上所述，菌株在蛋白胨和牛肉膏体系中均能产生H2O2，而在牛肉膏体系中浓度更高；另外，H2O2的产生与菌株的生长期有关.

(a) 蛋白胨

(b) 牛肉膏

图2 不同浓度蛋白胨和牛肉膏对产胞外的影响

图3 6 g/L蛋白胨和牛肉膏对产胞外的影响

2.2 OPs对胞外ROS形成特性影响

2.2.1 OPs对产胞外H2O2的影响 实验选取6 g/L蛋白胨体系考察了IBP、SMX、NAP、DMP等海洋环境中常见的OPs对菌株GCY产胞外H2O2的影响.实验结果如图4所示.首先，各OPs体系中，H2O2的产生均与菌株的生长周期相关，对数期没有检测到H2O2，稳定期末期浓度有明显上升；另外，在添加了IBP体系中，添加浓度越高，同一时刻的H2O2的浓度越高；而SMX、NAP、DMP体系则对胞外H2O2浓度无明显影响.除此之外，实验还发现苯酚和双酚A促进菌株GCY产胞外H2O2.

2.3 胞外ROS形成机理分析

2.3.1 胞外H2O2形成机理分析 Seaver等[22]研究发现Escherichiacoli细胞可通过胞内抗氧化系统控制胞内H2O2在很低水平，约0.2 μmol/L，且由于H2O2向胞外扩散的速率有限，对胞外H2O2浓度贡献有限.实验观察到图1中多处胞外H2O2浓度远大于0.2 μmol/L，故推测胞外H2O2主要是胞外生成.另外，以前普遍认为，H2O2在生物膜上的转运为自由扩散，但是最近研究表明H2O2的转运不是简单的自由扩散，有的生物膜对H2O2的透过性较差，而通道蛋白可能促进H2O2的扩散[23].当外加适量浓度的H2O2，对于不同生物膜，胞内胞外H2O2处于稳态平衡时，胞外H2O2浓度普遍是胞内H2O2浓度的7～10倍，有的高达650倍[24]，因此图1中胞外H2O2浓度达到近10 μmol/L是合理的.

(a) IBP

(b) SMX

(c) NAP

(d) DMP

(a) IBP

(b) SMX

(c) NAP

(d) DMP

本课题组前期研究发现，菌株GCY产胞外H2O2与LAAO有关，且该LAAO对L-亮氨酸反应活性最强[6].以6 g/L蛋白胨和牛肉膏体系为例，通过测定体系中CAT活性和LAAO活性(图6)，发现不同时期的CAT活性存在差异，对数期最强，后逐渐减弱；LAAO活性在对数期为零，稳定期逐渐增强，衰亡期减弱.LAAO和CAT在合适条件下可分别产生和消耗H2O2，因此两者反应的相对强弱可导致胞外H2O2浓度的动态变化，CAT活性逐渐降低，而LAAO活性升高，这可能是体系中H2O2浓度升高的原因.

图6 6 g/L牛肉膏体系中CAT和LAAO活性

与菌株GCY同属的Pseudoalteromonastunicata产生的抗菌自溶蛋白AlhP及海洋细菌Marinomonasmediterranea分泌的胞外酶L-赖氨酸-ε-氧化酶(LodA)是同源物，二者均能在生物膜发育过程中通过产生H2O2介导细胞死亡[25]，本课题组前期研究发现，LodA等LAAO的编码序列存在于菌株GCY的基因组中[17].鉴于此，推测菌株GCY也可分泌LodA等LAAO，通过产生H2O2介导细胞死亡；Gmez等研究发现Marinomonasmediterranea在稳定期分泌LodA至胞外[26]，这与实验结论2.1.1中对数期没有检出H2O2，稳定期H2O2浓度逐渐升高及对数期LAAO活性为零(图6)一致，因此推测胞外H2O2的产生为生长非偶联型.

为验证200 mg/L的IBP促进产胞外H2O2与胞外CAT和LAAO活性有关，实验考察了体系84 h时对这两种酶活性A的影响，结果如图7所示，表明添加不同浓度的IBP对于CAT的活性影响不大，但是添加200 mg/L的IBP大大增强了LAAO活性.

图7 IBP对CAT和LAAO活性的影响

3 结 语