冀东野生大豆(Glycine soja)耐盐碱性鉴定及耐性生理指标测定

符杨磊 魏志园 王 宇 刘潇阳 王冰冰 乔亚科 李桂兰 张 锴,*

(1河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北 秦皇岛 066000；2河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛 066000)

盐碱地是遍布全球的一种土壤类型，具有较大的潜在利用价值。我国有近4 000万hm2盐碱荒地和200万hm2沿海滩涂，尤其是冀东滨海地区盐碱地分布广泛。冀东地区盐渍化土壤呈沿海带状纵深分布，pH值最高达8.0，土壤pH值高于7.5的土地面积达34%[1]。土壤盐碱化会导致土粒高度分散或板结，渗水性失调，严重影响植物在土壤中扎根生长。由于缺少耐盐碱作物品种，不适合传统作物生长的盐碱地得不到充分利用，因此，筛选耐盐碱作物种质资源是充分利用盐碱地资源，解决日益增长的粮食需要与耕地面积不足之间矛盾的重要途径之一。我国是大豆的起源地，保存有丰富的野生大豆(Glycinesoja)资源。野生大豆资源中蕴含丰富的抗性基因，与耐盐碱相关的基因可参与调控植株盐碱胁迫反应[2-4]，增强耐盐碱能力，且已通过转基因验证[5-6]。野生大豆中的抗性基因可用于拓宽栽培大豆的遗传基础，培育抗性栽培大豆新品种。

盐碱胁迫对植物的伤害主要表现在渗透胁迫、离子毒害[7]和高pH值损伤，胁迫下植物细胞内Na+浓度升高，造成脂质过氧化，并伴随着电解质的外渗[8-9]。丙二醛(malondialdehyde, MDA)是脂质过氧化的产物，其含量反映了质膜脂质过氧化水平；电解质外渗率是判断电解质外渗水平的指标，反映了细胞在胁迫状态下的损伤程度；可溶性糖和脯氨酸可以调节细胞渗透压，在盐碱、干旱等胁迫下脯氨酸及可溶性糖含量有升高的趋势[10-12]。植株体内脯氨酸合成关键酶吡咯琳-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)、吡咯琳-5-羧酸还原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)及介导脯氨酸降解的脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase，PDH)对胁迫下植株脯氨酸含量具有重要调节作用[13-14]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，P5CS基因可由干旱、盐胁迫和植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)诱导[15]。过表达P5CS的转基因烟草植株中脯氨酸含量升高，对渗透胁迫耐性增强[16]。因此，P5CS和P5CR对植物脯氨酸的生物合成及维持细胞渗透平衡具有重要意义[17]。此外，王臻昱等[18]对野生大豆GsGST19基因功能进行研究，发现过表达GsGST19基因的苜蓿耐盐碱能力提高。鉴于脯氨酸代谢酶基因及GSTs基因在植物耐盐碱胁迫中的作用，本研究选取GmP5CS、GmP5CR、GmPDH和GsGST19基因以研究不同耐性野生大豆材料在盐碱胁迫下基因的表达情况。

本研究对349份野生大豆种质资源进行抗盐碱性鉴定，对不同耐性野生大豆种质在盐碱胁迫下的脯氨酸、MDA、可溶性糖含量，电解质外渗率及GmP5CS、GmP5CR、GmPDH和GsGST19基因的表达进行测定，旨在筛选高耐盐碱的野生大豆材料，为野生大豆抗盐碱资源利用、抗性机理研究和培育优质抗性大豆新品种提供育种材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生大豆材料共349份，由河北科技师范学院野生大豆资源课题组提供。

1.2 试验设计

野生大豆籽粒利用小刀破泥浆膜后播种于直径10 cm的营养钵内。钵中培养介质以营养土和蛭石按等体积配置。每钵播种3粒野生大豆，每个野生大豆材料种植9钵，置于温室中生长。温室温度25℃/15℃，每天日照时长14 h。待幼苗第一对真叶完全展开后进行盐碱液处理，盐碱液按NaCl∶Na2CO3(无水)=1∶3质量分数配置(调pH值至8.0)。盐碱液浓度为0(CK)、100和200 mmol·L-1，每种浓度处理3钵。每隔3 d浇一次盐碱液，每次150 mL，共浇3次。最后一次处理3 d后用清水进行透灌。设置3次生物学重复。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 野生大豆耐盐碱性等级调查 清水透灌3 d后，按照罗教芬[19]的方法进行耐盐碱性等级调查。具体分为5等级：1级(高耐)：植株未表现受害症状，生长与CK无差异；2级：植株生长基本正常，个别植株下部有萎蔫症状；3级：植株受害症状(主要为叶片表现枯萎症状)达整个植株三分之一；4级：植株受害症状达整个植株二分之一；5级：植株受害症状在整个植株二分之一以上，甚至死亡。

每个野生大豆材料调查9株，盐碱性等级取9株中受害等级最高者。本试验选取高耐材料1份、敏感材料2份进行后续指标的测定。

1.3.2 脯氨酸含量测定 由于盐碱胁迫下植物脯氨酸含量有升高趋势[10, 12]，故测定了盐碱胁迫下野生大豆材料脯氨酸含量。于盐碱胁迫处理0(处理后立即取样)、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株叶片加入3 mL 3%磺基水杨酸溶液，煮沸10 min，过滤，滤液加入2 mL冰醋酸和2 mL 2.5%酸性茚三酮溶液，沸水煮沸30 min。溶液冷却后加入4 mL甲苯，充分摇荡混匀，静置分层后用移液枪吸取上层液至新的10 mL离心管中，3 000 r·min-1离心5 min，上清液利用UV1901PC型紫外分光光度计(上海奥析公司)于520 nm波长处读取吸光度值。

1.3.3 MDA含量测定 分别于盐碱胁迫处理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株叶片，加入2 mL 5%三氯乙酸溶液，研磨后3 000 r·min-1离心10 min。吸取1 mL上清液至新的离心管中，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，充分混匀后沸水煮沸30 min，3 000 r·min-1离心10 min，上清液分别于450、532和600 nm波长处测定吸光度值。

1.3.4 可溶性糖含量测定 分别于盐碱胁迫处理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株叶片，加入10 mL蒸馏水，沸水煮沸20 min，冷却至室温后定容至100 mL。取1 mL定容液加入5 mL 0.2%蒽酮溶液，于620 nm波长处测定吸光度值。

1.3.5 电解质外渗率测定 分别于盐碱胁迫处理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株叶片材料于离心管中，加入10 mL去离子水，将离心管放入真空干燥机中用真空泵抽气10 min，抽气后缓缓打开阀门，将离心管取出后于室温放置24 h，期间多次晃动，促进水分交换，利用DDS-307电导仪(上海仪分科学仪器有限公司)测定其电导值，作为初值(K1)，以去离子水为空白对照组。测完初值的离心管放入沸水中煮沸10 min，以杀死细胞组织，待其冷却至室温后，摇匀，测其电导值，作为终值(K2)。根据公式计算电解质外渗率：

电解质外渗率=K1/K2×100%

(1)。

1.3.6 耐盐碱相关基因表达测定 分别于盐碱胁迫处理0、3、10、24、48 h后取野生大豆材料植株叶片提取总RNA，反转录得cDNA。以cDNA为模板，β-Tubulin为内参基因进行耐盐碱相关基因表达量测定。GmP5CS、GmP5CR和GmPDH基因序列通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取，其GenBank登录号分别为AY492005 547907和NM_001250359，GsGST19(JQ031560)基因序列通过王臻昱等[18]研究报告获取。利用Primer Premier 5.0软件设计基因全长序列的定量PCR引物(表1)。利用CFX96型荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)进行定量PCR测定，试剂盒采用One Step SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR 试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.4 数据分析

试验数据利用SAS 9.2和Microsoft Excel 2003进行统计，利用Duncan’s多重比较法进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 冀东野生大豆耐盐碱鉴定结果

349份野生大豆进行耐盐性鉴定结果如表2所示。由于200 mmol·L-1盐碱液处理野生大豆后全部植株的耐盐碱等级均表现为5级，故本研究结果为100 mmol·L-1盐碱液处理后野生大豆的耐盐碱性等级。表现1级的高耐材料有Yong 2和2010-12，占总数的0.57%；表现2级的耐性材料有22份，占总数的6.30%；表现3级的材料共80份，占总数的22.92%；表现4级的材料共77份，占总数的22.06%，表现5级的材料共161份，占总数的46.13%。冀东地区野生大豆材料对盐碱胁迫表现3级及以上的占总数的91.11%，表明这些野生大豆材料对本试验中所用盐碱处理水平的耐性较差。筛选到野生大豆材料Yong 2和2010-12对盐碱胁迫耐性好，可作为耐盐碱相关研究的种质材料。

表2 野生大豆耐盐碱鉴定结果Table 2 Results of salt and alkali tolerance of wild soybean

表2(续)

2.2 盐碱胁迫下3种野生大豆材料的脯氨酸含量

高耐野生大豆材料2010-12和敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在100与200 mmol·L-1盐碱液胁迫下脯氨酸含量测定结果如图1所示。高耐野生大豆材料2010-12在盐碱胁迫处理后脯氨酸含量在各胁迫时间点均较CK显著升高，并且100与200 mmol·L-1的盐碱液处理间无显著差异。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49脯氨酸含量在2种浓度的盐碱液胁迫处理下随着胁迫时间的延长与CK均无显著差异。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note： Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.图1 不同野生大豆材料在盐碱胁迫下的脯氨酸含量Fig.1 Proline content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

图2 盐碱胁迫下不同野生大豆材料MDA含量Fig.2 MDA content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.3 盐碱胁迫下3种野生大豆材料MDA含量

由图2可知，高耐野生大豆材料2010-12在100与200 mmol·L-1盐碱液处理下MDA含量在各胁迫时间点与CK相比均无显著差异。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在盐碱胁迫处理后各胁迫时间点MDA含量均较CK显著升高，2种浓度盐碱胁迫处理间无显著差异。

2.4 盐碱胁迫下3种野生大豆材料可溶性糖含量

由图3可知，高耐野生大豆材料2010-12在100与200 mmol·L-1的盐碱胁迫后可溶性糖含量均较CK显著升高，但2种浓度盐碱液处理间无显著差异。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2种浓度的盐碱液胁迫处理下各胁迫时间点与CK均无显著差异。

图3 盐碱胁迫下不同野生大豆材料可溶性糖含量Fig.3 Soluble sugar content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.5 盐碱胁迫下3种野生大豆材料电解质外渗率

盐碱胁迫下3份野生大豆植株电解质外渗率的测定结果如图4所示。100与200 mmol·L-1盐碱液胁迫下，高耐野生大豆材料2010-12在各胁迫时间点电解质外渗率与CK相比均无显著差异。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2种浓度盐碱液处理下各胁迫时间点均较CK显著升高，且2种浓度盐碱液处理间无显著差异。

图4 盐碱胁迫下不同野生大豆材料电解质外渗率Fig.4 Electrolyte exosmosis rate in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.6 盐碱胁迫下3种野生大豆材料基因表达结果

盐碱胁迫下野生大豆材料耐盐碱相关基因表达情况如图5所示，高耐盐碱野生大豆材料2010-12在2种浓度盐碱胁迫后GmP5CS、GmP5CR和GsGST19的表达量均升高，在各胁迫时间点与CK相比均达到差异显著水平；GmPDH的表达量降低，在各胁迫时间点与CK相比均达到差异显著水平。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2种浓度盐碱胁迫后4个基因的表达量与CK相比均无显著差异。

3 讨论

野生大豆中的优异基因是栽培大豆优异基因的重要来源，对于拓宽栽培大豆遗传多样性十分重要。目前已发现一些高耐盐碱的野生大豆种质资源。葛瑛等[20]对采集于吉林省白城市的345份野生大豆材料进行耐盐碱性鉴定，筛选得到9份耐盐碱性较强的野生大豆材料；肖鑫辉等[21]对津唐渤海湾沿海地区的895份野生大豆材料进行高浓度盐碱胁迫，发现只有8.5%的材料活到了成熟期，最终筛选出15份耐盐碱较好的野生大豆种质。这些研究表明自然界中存在高耐盐碱的野生大豆种质资源。本研究利用采集于冀东地区的349份野生大豆种质进行耐盐碱性鉴定，处理的盐碱液浓度为100 和200 mmol·L-1，比一般研究所用盐碱胁迫浓度高，目的是在高浓度盐碱胁迫下筛选极端耐盐碱的野生大豆种质资源。研究发现耐性等级为3、4、5的野生大豆材料占绝大多数(93.13%)，可能与盐碱胁迫处理的浓度较高有关；耐性等级1级和2级的野生大豆种质共24份(6.87%)，可作为优异种质培育耐盐碱栽培大豆。

Yu等[22]发现在盐碱胁迫下，菜豆(Phaseolusvulgaris)植株体内可溶性糖和脯氨酸含量升高，这对保持细胞离子平衡，维持细胞pH值有一定作用。此外，Jiao等[23]研究发现在盐碱胁迫下，高耐野生大豆材料体内的脯氨酸合成通路较敏感材料显著激活，符杨磊[24]发现野生大豆脯氨酸含量在盐碱胁迫48 h后较对照显著增加。本研究对盐碱胁迫下不同耐性水平野生大豆植株体内MDA、脯氨酸、可溶性糖含量和电解质外渗率进行测定，结果与前人相似。高耐盐碱野生大豆2010-12在盐碱胁迫下植株体内脯氨酸和可溶性糖含量较CK显著升高，MDA含量与电解质外渗率与CK无显著差异。说明高耐材料在盐碱胁迫下电解质外渗率低，能够维持较稳定的离子平衡，与其脯氨酸及可溶性糖含量升高有关。脯氨酸和可溶性糖对植物细胞渗透调节十分重要[25]，多种植物在盐碱胁迫下脯氨酸和可溶性糖含量均呈升高趋势[26-29]。但也有研究表明，脯氨酸含量升高与植株的耐盐碱性无相关性，其含量升高只是植株在逆境下的一种被动反应。如Chen等[30]发现盐碱胁迫下，耐盐大麦(Hordeumvulgare)材料植株脯氨酸含量与对照无显著差异，而Lacerda等[31]发现感性高粱(Sorghumbicolor)材料植株体内积累了更多的脯氨酸，此外Lv等[32]发现水稻(Oryzasativa)在盐碱胁迫下全部材料体内脯氨酸含量均升高。综上所述，植物在盐碱胁迫下脯氨酸积累量与其耐性水平的相关性需进一步研究。

在渗透胁迫下，P5CS和P5CR是脯氨酸合成的关键酶，渗透胁迫解除后，PDH对植物脯氨酸含量恢复至正常状态十分重要[33]。如Tavakoli等[34]和Lv等[35]分别对小麦(Triticumaestivum)和水稻进行了相关研究，发现在盐胁迫处理下，小麦植株体内P5CS和P5CR上调表达、PDH下调表达，脯氨酸含量升高[34]，水稻植株体内脯氨酸合成基因(OsP5CS1，OsP5CS2和OsP5CR)以及降解酶基因(OsPDH1)的表达量显著上调，脯氨酸含量升高[35]。本研究测定了脯氨酸合成相关基因GmP5CS、GmP5CR以及降解相关基因GmPDH的表达量，结果与前人相似。在盐碱胁迫下，高耐野生大豆材料2010-12中GmP5CS和GmP5CR上调表达，GmPDH下调表达，而在敏感野生大豆材料2012-34和2012-49中GmP5CS、GmP5CR及GmPDH的表达量与CK无显著差异。以上结果说明，盐碱胁迫下高耐野生大豆材料脯氨酸合成通路激活，结合其细胞内脯氨酸含量升高，表明在盐碱胁迫下，高耐野生大豆材料脯氨酸的上调可能与其抗性较高有关。

4 结论

本研究对采集于冀东地区的349份野生大豆材料进行耐盐碱性鉴定，发现Yong 2和2010-12等野生大豆材料对盐碱胁迫耐性较高，为培育耐盐碱栽培大豆提供了种质资源。另外，在盐碱胁迫下，高耐盐碱野生大豆GsGST19表达量显著升高，说明GsGST19基因在植株盐碱胁迫调节过程中发挥了重要作用，这对GSTs基因功能研究具有重要意义。此外，高耐盐碱野生大豆材料脯氨酸及可溶性糖含量显著升高，丙二醛含量及电解质外渗率无显著变化，脯氨酸合成关键酶基因GmP5CS和GmP5CR上调表达，降解关键酶基因GmPDH下调表达，说明盐碱胁迫下高耐盐碱野生大豆脯氨酸合成通路激活，脯氨酸积累量升高，这对野生大豆抵抗盐碱胁迫十分重要。