小麦-顶芒山羊草2M染色体系的鉴定与评价

宫文萍 张 伟 李豪圣 李光蓉 张玉梅 杨足君 刘 成,* 刘建军,*

(1 山东省农业科学院作物研究所/农业农村部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室，山东 济南 250100；2 青岛农业大学农学院，山东 青岛 250208；3 电子科技大学生命科学与技术学院，四川 成都 610054)

小麦的近缘物种含有小麦育种所需的抗病、抗逆等基因，因此，将其优异性状基因导入小麦是实现小麦遗传改良的重要途径之一[1]。顶芒山羊草(Aegilopscomosa，又称Triticumcomosum，MM)，作为卵穗山羊草(Ae.geniculata，UUMM)、小亚山羊草(Ae.columnaris，UUMM)、三芒山羊草(Ae.neglecta，UUMM或UUMMNN)、牡山羊草(Ae.juvenalis，DDMMUU)和粗厚山羊草(Ae.crassa，DDMM或DDDDMM)等物种的M染色体组的供体种[2]，具有高抗小麦条锈病[2-3]、叶锈病[4]、秆锈病[2-3,5]、白粉病[6]、禾谷孢囊线虫病[7]、小麦黑森瘿蚊病[4]和盐碱耐受性[8]等优异特性，是普通小麦重要的三级基因源[1]。将小麦三级基因源与小麦进行杂交，通过胚拯救、染色体加倍或回交等方法，可以获得相应的染色体双二倍体、附加系或代换系等材料。

小麦-近缘物种双二倍体、附加系、代换系和易位系等材料是向小麦转移近缘物种优异基因的重要桥梁材料[9]，以这些材料为基础创制的小麦-外源染色体易位系在小麦育种中具有重大的应用价值。例如，育种家们以抗小麦多种病害且丰产性好的小麦-黑麦1RS.1BL易位系及其衍生系为亲本，育成了山前麦、高加索、无芒一号和洛夫林13等高产抗病小麦，在推动小麦品种更新换代中发挥了重要作用[10-12]；以抗条锈病且含普通小麦-长穗偃麦草易位系的小偃6号[13]为亲本育成了西农928、陕优225和郑麦366等50余个小麦品种；以含抗白粉病基因Pm21的小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系为亲本，选育出南农9918、石麦14、金禾9123和扬麦18等20余个小麦新品种[14-16]；以及辐射处理六倍体小黑麦黑杂266与普通小麦杂交种子选育出含有6BS/6RL易位系的龙辐麦4号[17]。目前，已有不少小麦-近缘物种染色体易位系被成功创制出来[18]。然而，仅少数小麦-近缘物种易位系在小麦生产中得到广泛利用[10]，原因可能是导入小麦中的近缘物种染色体片段无法补偿被替换染色体片段的某些优异性状，或者是易位系所在小麦背景较差不适宜直接应用等[19-20]。但小麦-近缘物种染色体易位系作为定位小麦近缘物种优异基因的有效工具，是向小麦转育优异基因的重要载体，有必要创制更多的小麦-近缘物种染色体易位系。

对小麦-近缘物种染色体双二倍体、附加系、代换系等材料的抗病性和农艺性状进行综合评价，是创制小麦-近缘物种染色体易位系的重要前提[21]。本研究利用顶芒山羊草2M染色体特异分子标记结合多聚核苷酸荧光原位杂交对小麦-顶芒山羊草杂交育成的新种质进行鉴定，并对其三锈病和白粉病抗病性进行检测，通过一年四点对小麦-顶芒山羊草新种质的株高、旗叶长和旗叶宽等8个农艺性状进行调查研究，综合评价所获得的小麦-顶芒山羊草染色体系的育种应用潜力，以期为后续开发利用这批种质资源提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

小麦品种济麦22(Jimai22)、济麦23(Jimai23)、济麦229(Jimai229)和济麦262(Jimai262)由山东省农业科学院作物研究所小麦遗传育种团队育成。小麦中国春(Chinese Spring，CS)由电子科技大学杨足君教授提供。中国春-顶芒山羊草双二倍体(XX019)，中国春-顶芒山羊草2M～7M附加系(JIC-3～JIC-8)，普通小麦品种Hobbit ‘sib’(JIC-46)，以及Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草异染色体系JIC-10、JIC-11、JIC-12、JIC-17，均由英国约翰英纳斯中心(John Innes Centre)的Reader SM教授提供。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩增 供试材料基因组总DNA提取方法参考文献[20]。PCR所用IT(intron target)引物根据簇毛麦基因内含子区多态性设计[22]，合成的染色体第一至第七同源群引物分别为135、175、120、89、140、71、111对。引物由青岛擎科天成生物技术有限公司合成。PCR扩增程序参考文献[22]，PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，然后于GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)下扫描照相。

顶芒山羊草2M染色体特异基于聚合酶链式反应独特基因标记(PCR-based landmark unique gene, PLUG)TNAC1138、TNAC1204、TNAC1137、TNAC1239、TNAC1206和TNAC1102对应引物[23]由成都瑞信生物公司合成， PCR扩增程序参考Ishikawa等[24]的方法。基于CS reference V1.0的BLASTN，将PLUG序列定位在小麦染色体(区段)上，所用网页(http://mcgb.uestc.edu.cn/tnac)由电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授课题组创建。

1.2.2 根尖处理与原位杂交 将种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中，于22℃恒温光照培养箱萌发。待种子萌动露白后，将培养皿转到4℃冰箱中低温处理24 h， 再放入22℃光照培养箱中恒温培养，待根尖长至1～2 cm时，剪下根尖，用冰水处理 24 h。之后用卡诺氏固定液Ⅰ(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1，v/v)固定根尖7 d以上，压片备用。

染色体压片参照文献[25]。以多聚核苷酸探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1对供试材料染色体制片进行双色荧光原位杂交，荧光原位杂交和染色体制片的洗脱方法参见文献[26]。杂交探针由成都瑞信生物公司合成。用BX53荧光显微镜(OLYMPUS，日本)进行镜检，DP70CCD拍照。

1.2.3 抗病性鉴定 供试材料抗条锈病鉴定在电子科技大学生命科学与技术学院完成，所用菌种为CYR32、CYR33和Su-4混合生理小种；抗叶锈病鉴定在河北农业大学植物保护学院完成，所用菌种为09-9-1441-1、09-9-1426-1、09-7-922-1、09-7-949-1和09-9-1505-1混合生理小种；抗秆锈菌病鉴定在沈阳农业大学植物保护学院完成，所用菌种为34MKGQM和21C3CTHSM混合生理小种；抗白粉病鉴定在山东省农业科学院作物研究所完成，所用白粉菌混合菌株采集于山东省农业科学院作物研究所济南试验基地(未鉴定具体小种)。4种病害接种方式、发病条件及发病等级统计方法分别参照文献[20, 27-29]。

1.2.4 农艺性状调查 供试材料分别种植于山东省济南市(山东省农业科学院作物研究所试验基地)、德州市(德州市农业科学研究院试验基地)、菏泽市(菏泽市农业科学院试验基地)和临沂市(临沂市农业科学院试验基地)，浇水、施肥、锄草和病虫害处理等管理条件一致。各供试材料随机播种3行(行长4 m)，设置3个生物学重复，严格按行距33 cm，株距20 cm进行播种，四周种植济麦22避免边行效应影响。每个供试材料随机取10株，于成熟期旗叶变干卷曲前，分别调查其株高、穗长、旗叶长、旗叶宽、分蘖数和主茎小穗数。每个供试材料随机取30穗，完全干燥后人工脱粒，分别调查其30穗穗粒数和30穗穗粒重。种植于济南的供试材料未获得分蘖数结果。

调查结果采用Microsoft Office Excel 2010进行方差分析。4个种植地调查结果完全一致的(如与对照相比，四地籽粒数均显著减少)，则认为是外源染色体导入所致，否则认为是外源染色质导入和环境因素共同作用所致，即差异不显著。

2 结果与分析

2.1 小麦-顶芒山羊草染色体系的分子标记筛选

以中国春-顶芒山羊草双二倍体为阳性对照，以中国春、普通小麦品种Hobbit ‘sib’、济麦22、济麦23、济麦229和济麦262为阴性对照，以Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草异染色体系JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17为材料，筛选合成的IT引物，开发顶芒山羊草M染色体特异分子标记。结果发现，仅染色体第二同源群的引物CINAU1060能同时在中国春-顶芒山羊草双二倍体、Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草异染色体系JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17中扩增出分子量为320 bp的多态性带(图1-A，表1)，而在阴性对照中扩增不出这些多态性带。以中国春、中国春-顶芒山羊草2M-7M附加系为材料进行PCR扩增，对所获标记进行染色体定位，结果发现，CINAU1060仅能在中国春-顶芒山羊草2M附加系中扩增出目标条带，说明该标记是顶芒山羊草2M特异标记，表明JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17中均含2M染色质(图1-A)。

为了确证上述结论，用6个顶芒山羊草染色体臂2M特异PLUG标记TNAC1138、TNAC1204、TNAC1137、TNAC1239、TNAC1206和TNAC1102(表1，*标注)对上述供试材料进行扩增验证，结果发现，JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17均能扩增出上述6个标记(表1)。其中，标记1137/TaqI的扩增结果见图1-B。上述6个标记中不仅有顶芒山羊草2MS染色体臂特异标记，还有2ML染色体臂特异标记，因此推断JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17中均含2ML和2MS染色体或染色体片段。

2.2 小麦-顶芒山羊草染色体系的细胞学鉴定

2.2.1 小麦-顶芒山羊草染色体系背景小麦细胞学鉴定 以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对小麦-顶芒山羊草染色体系的小麦背景材料Hobbit ‘sib’进行荧光原位杂交分析，结果发现，与Tang等[26]报道的中国春的信号相比，Hobbit ‘sib’在1D染色体短臂末端、5A长臂中部、1B和6B随体有Oligo-pTa119.2-1信号，而中国春在这些位置无相应信号。中国春在染色体4A长臂末端有Oligo-pTa119.2-1信号，5A长臂中部有Oligo-pTa535-1信号，而Hobbit ‘sib’在4A长臂末端和5A长臂中部无相应信号，其5B与7B之间发生罗伯逊易位形成5BS.7BS和5BL.7BL易位系(图2-A)。

2.2.2 小麦-顶芒山羊草附加系和代换系的细胞学鉴定 以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草异染色体系JIC-10和JIC-11进行双色FISH分析，结果显示，JIC-10含有44条染色体，其中，42条与亲本Hobbit ‘sib’完全一致，另外1对染色体的杂交信号和长短臂比例与已报道的顶芒山羊草2M染色体[30]完全相同(图2-B)，因此，JIC-10是小麦-顶芒山羊草2M附加系。JIC-11含有42条染色体，其中40条染色体FISH信号与Hobbit ‘sib’完全相同，而1对2D染色体丢失，另外1对染色体的杂交信号和长短臂比例与顶芒山羊草2M染色体[30]完全相同，因此，JIC-11是小麦-顶芒山羊草2M(2D)代换系。

2.2.3 小麦-顶芒山羊草易位系的分子细胞学鉴定 以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草异染色体系JIC-12进行双色FISH分析，结果显示，该材料含有42条染色体，其中40条染色体信号与Hobbit ‘sib’完全相同，缺失1对2A染色体，另外1对染色体短臂信号与2MS信号一致，但长臂的Oligo-pSc119.2-1信号丢失(图2-C)。TNAC1204和TNAC1137等顶芒山羊草2ML长臂特异标记扩增结果显示，JIC-12能扩增出2ML-0.27-0.94区段上的特异标记。根据分子标记结果、FISH杂交信号及染色体臂比信息，确定该染色体为2M染色体且2ML末端发生了染色体小片段丢失。引物TNAC1102(所在染色体位置为2AS5-0.78-1.00[24])对 JIC-12的扩增结果显示，JIC-12可以扩增出染色体2AS特异条带，说明JIC-12中含2AS染色质，其2AS染色质易位到2ML末端形成了2AS-2ML.2MS易位系(图2-C，图3)。

以Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1为探针对Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草异染色体系JIC-17进行双色FISH分析，结果显示，该材料含有42对染色体，其中40条染色体信号与Hobbit ‘sib’完全相同，但缺失1对2D染色体，另外1对染色体短臂信号与2MS的信号一致，长臂末端有很强的Oligo-pSc119.2-1信号，与染色体2ML末端信号不符(图2-D)。利用引物TNAC1102和TNAC1137对 JIC-17进行扩增，结果显示，两对引物可在JIC-17中扩出定位在2DS(2DS5-0.47-1.00)的条带[24]，且TNAC1137在JIC-17中未能扩增出定位在2DL的特异条带[24]，表明JIC-17中含有2DS染色质。根据分子标记结果、FISH杂交信号及染色体臂比信息，确定2D短臂末端易位到染色体2M长臂上形成了2DS-2ML.2MS易位系(图2-D，图3)。

伏于平原第四系或第三系之下，主要岩性为砂岩、砂砾岩，局部为熔岩。其中赋存风化裂隙及孔隙裂隙承压水。承压水头高度5.00 m，当孔径219 mm时单井涌水量为800.0 m3/d，单位涌水量为 9.26 L/（s·m）， 渗透系数1.81m/d。

2.3 小麦-顶芒山羊草染色体系的抗病抗逆性调查

以中国春和Hobbit ‘sib’为对照，对Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草2M附加系(JIC-10)、2M(2D)代换系(JIC-11)、2AS-2ML.2MS 易位系(JIC-12)和2DS-2ML.2MS易位系(JIC-17)进行三锈病(条锈病、叶锈病、秆锈病)和白粉病抗病性鉴定，结果表明，所有供试材料均中感或高感叶锈病、秆锈病和白粉病(表2)。中国春和Hobbit ‘sib’高感条锈病，但小麦-顶芒山羊草2M染色体系均近免疫条锈病(表2)，表明顶芒山羊草2M染色体上含有抗条锈病基因。

表2 供试材料的抗病性调查结果Table 2 Investigation results of disease resistance of the materials tested

2.4 小麦-顶芒山羊草染色体系的农艺性状调查

以亲本Hobbit ‘sib’为对照，对Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草2M附加系(JIC-10)、2M(2D)代换系(JIC-11)、2AS-2ML.2MS 易位系(JIC-12)和2DS-2ML.2MS易位系(JIC-17)在四地(德州、菏泽、济南和临沂)的株高、穗长、旗叶长、旗叶宽、分蘖数和小穗数等农艺性状进行调查，方差分析结果表明，与Hobbit ‘sib’相比，2M染色体的导入对小麦株高(图4-A)、穗长(图4-B)、旗叶长(图4-C)、分蘖数(图4-E)和穗粒数(图5-A)均无显著影响。

小麦-顶芒山羊草2M附加系、2M(2D)代换系和2DS-2ML.2MS易位系的旗叶宽与对照Hobbit ‘sib’相比，差异不显著，但小麦-顶芒山羊草2AS-2ML.2MS易位系的旗叶宽较对照极显著变窄(图4-D)，这可能是2M染色体导入与小麦2AL染色体丢失共同作用的结果。供试材料的小穗数(图4-F)较Hobbit ‘sib’均显著或极显著变少(仅德州小麦-顶芒山羊草2M附加系和2DS-2ML.2MS易位系除外)，说明2M染色体导入可能导致小穗数变少。

由图5-A可知，与对照Hobbit ‘sib’相比，Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草2M附加系、Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系的30穗穗粒数显著减少，表明顶芒山羊草2M染色体导入是导致小麦穗粒数减少的原因。2M(2D)代换系的30穗穗粒数与Hobbit ‘sib’差异不显著，可能是小麦2D染色体的丢失减轻了顶芒山羊草2M染色体导入对小麦穗粒数产生的负效应。由图5-B可知，与对照Hobbit ‘sib’ 相比，小麦Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草2M附加系、2M(2D)代换系、2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系的30穗穗粒重均显著降低(图5-B)，说明2M染色体的导入是小麦穗粒重降低的主要原因。

3 讨论

在山羊草属物种分子标记建立方面，刘旭等[31]利用132条随机引物对高大山羊草及对照进行分析，建立了7个高大山羊草基因组RAPD 标记；吴红坡等[32]选取400对小麦SSR引物对卵穗山羊草以及小麦-卵穗山羊草衍生后代进行筛选，获得10个卵穗山羊草特异SSR标记；Gong等[21,33]先后筛选PLUG引物、EST-STS引物、SSR引物和COS引物，分别建立了42、55个单芒山羊草和尾状山羊草基因组分子标记；翁跃进等[34]利用29个小麦探针和6种限制性内切酶对顶芒山羊草M染色体组进行RFLP分析，获得40个RFLP分子标记；Liu等[23]利用PLUG引物对顶芒山羊草染色体组分子标记进行开发，获得47个染色体特异标记，其中7个2M染色体特异标记。近期，基于簇毛麦基因内含子序列的IT分子标记已经被开发出来[22]。但利用IT引物对山羊草标记的报道较少。本研究以Hobbit ‘sib’为对照，以含顶芒山羊草染色质的材料为基础对这批来自簇毛麦的分子标记进行筛选，获得1个顶芒山羊草2M染色体特异标记，为检测小麦背景中顶芒山羊草2M染色质提供了新的方法。但本研究筛选IT引物获得染色体第二同源群标记的效率仅为1.1%，低于文献[23,32-34]获得标记的效率，这可能是由于用琼脂糖进行电泳而未用分辨率较高的聚丙烯酰氨凝胶进行电泳造成的。

在小麦-顶芒山羊草染色体系创制与鉴定方面，自上世纪60年代至今，仅英国和中国科学家开展了利用顶芒山羊草进行小麦遗传改良的研究[3,35-36]。Riley等[3,35]最早将顶芒山羊草的抗病基因Sr34和Yr8转移到小麦中，获得了小麦-顶芒山羊草2M附加系、2DL/2M和2DS/2M易位系；1997年我国翁跃进等[6,36]利用花药培养创造小麦-顶芒山羊草异源附加系并利用RFLP标记从小麦-顶芒山羊草杂交后代中筛选出了4M(4D)代换系。Nasuda等[37]利用C带和基因组原位杂交鉴定出了小麦-顶芒山羊草易位系T2AS-2M#1L.2M#1S和T2DS-2M#1L.2M#1S；Liu等[23]从中国春-顶芒山羊草杂交种质中鉴定出了中国春-顶芒山羊草2M-7M附加系和6M(6A)代换系。本研究对Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草杂交种质进行鉴定，从中鉴定了Hobbit ‘sib’-顶芒山羊草2M附加系、2M(2D)代换系、2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系。因为本研究所鉴定材料和Nasuda等[37]鉴定的小麦-顶芒山羊草#1染色体系均源自英国John Innes Centre，且其小麦背景都是Hobbit ‘sib’，所以，本研究鉴定的2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系即小麦-顶芒山羊草易位系T2AS-2M#1L.2M#1S易位系和T2DS-2M#1L.2M#1S。本研究建立的2M染色体IT标记与Liu等[23]建立的PLUG标记和顶芒山羊草FISH核型，以及Nasuda等[37]建立的RFLP标记结果能够相互印证，这表明上述分子与细胞遗传方法在鉴定小麦-顶芒山羊草种质方面都是准确的。

条锈病是影响小麦最严重全球性病害之一，目前，已报道的抗条锈病基因有200余个，被正式命名的有80个[38-39]。来源于山羊草属的抗条锈病基因有7个，其中Yr8来源于顶芒山羊草[3]，Yr17来源于偏凸山羊草[40]，Yr28来源于粗山羊[41]，Yr37来源于粘果山羊草[42]，Yr38来源于沙融山羊草[43]，Yr40来源于卵穗山羊草[44]，Yr42来源于短柄山羊草[45]。来源于顶芒山羊草的Yr8是Riley等[3]利用遗传诱导同源重组技术导入小麦的。然而，Wan等[46]发现，该基因对中国条锈菌生理小种已经失去抗性。本研究发现来自2M染色体上的抗条锈病基因对条锈菌CYR32、CYR33和Su34混合生理小种具有良好抗性，推测2M染色体上存在新的抗条锈病基因。

李桂萍等[16]对小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系的F2群体和高代品系的产量、株高、穗长、穗粒数等农艺性状进行调查研究，发现6VS.6AL对小麦穗长和千粒重有一定的正向效应，对其他农艺性状无明显影响。李俊等[47]发现小麦-黑麦1RS-7DS.7DL易位系对小麦农艺性状中千粒重无负作用；任天恒等[48]发现以白粒黑麦为供体育成的1RS.1BL易位系T956-13可以提高小麦千粒重和穗数从而达到提高产量的目的。本研究发现导入顶芒山羊草2M染色体对小麦株高、穗长、旗叶长、旗叶宽和分蘖数未产生显著影响，对小穗数、穗粒数和千粒重可能产生显著负效应。因此，在利用顶芒山羊草2M染色体上的抗条锈病基因的小片段易位系时，应加大对诱导群体的选择，并适当利用当前主栽小麦对其进行回交转育。

4 结论

本研究鉴定的小麦-顶芒山羊草染色体系分别是小麦-顶芒山羊草2M附加系、2M(2D)代换系、2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系，对当前条锈菌流行小种CYR32、CYR33和Su-4具有良好抗性。顶芒山羊草2M染色体上可能含有不同于Yr8的抗条锈病新基因，值得利用染色体工程对其进行诱导以应用于小麦抗病育种，但2M染色体导入可对小麦产量性状的形成产生负效应，因此，在创制、筛选和利用抗病染色体小片段易位系时应注意对其负效应进行剔除。本研究鉴定出的抗条锈病小麦-顶芒山羊草2M染色体系丰富了小麦抗病基因库，为小麦育种提供了新抗源；为小麦-顶芒山羊草2M染色体系的综合评价，以及材料的后续开发利用奠定了基础。

致谢：感谢河北农业大学植物保护学院闫红飞教授和沈阳农业大学植物保护学院李天亚教授在试验材料叶锈病和秆锈病鉴定方面给予的帮助。感谢德州农科院刘鹏研究员、临沂农科院李宝强研究员、菏泽农科院郭凤芝研究员在试验材料种植、管理和农艺性状统计方面给予的帮助。