辣木叶提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制

钟英英，周佳明，叶美凤，何湘惠，邢韩寒，叶云

广西科技大学生物与化学工程学院（柳州 545006）

辣木为辣木科辣木属多年生热带乔木，因其有辛辣味的根而得名[1]。辣木作为一种新开发利用的食品，其具有生长迅速、营养丰富等优点，具有广阔的开发利用前景[2-3]。近年来，对辣木叶的综合利用主要表现在辣木有效成分的提取及保健食品开发。

黄嘌呤氧化酶能催化氧化黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸[4]，当体内尿酸浓度过高可能会引起高尿酸血症进而引发痛风[5]。黄嘌呤氧化酶抑制剂作为治疗痛风的最主要药物具有良好的发展前景，它可以通过降低黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸的生成，进而减少尿酸在体内的含量而达到治疗痛风的目的[6-7]。然而，市面上常用的黄嘌呤氧化酶抑制剂通常毒副作用较多，会引发药疹、发热、头痛、肝脏损害及过敏等副反应[8-9]，严重威胁人体健康。因此，开发天然无毒副作用安全的降尿酸药物，成为重要研究方向。试验通过探讨辣木叶提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用，为研究安全新型的降尿酸药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将辣木叶洗净、烘干、粉碎后过筛，置于阴凉干燥处密封保存备用。

别嘌呤醇、黄嘌呤氧化酶（上海源叶生物科技有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 辣木叶提取单因素试验

准确称量1.000 g辣木叶细粉，于超声波-微波协同萃取仪进行提取，固定超声波、微波功率分别为50 W、200 W，改变时间（700，800，900，1 000和1 100 s）、乙醇体积分数（40%，50%，60%，70%和80%）、提取温度（40，50，60，70和80 ℃）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL））4个因素的不同水平进行萃取。将所得提取液离心、浓缩得浸膏。配成40 mg/mL提取液，测定其抑制率。

1.2.2 正交试验

在单因素试验基础上，以黄嘌呤氧化酶的抑制率为指标，参考刘静波等[10]试验，设计L9(34)正交表，确定最佳提取条件。开展验证试验，重复3次，求RSD值。

1.2.3 黄嘌呤氧化酶活性抑制试验

按照表1的顺序加入药品混合均匀，25 ℃水浴反应1 min，终止反应，290 nm测吸光度。提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率（I）为：OD1～OD4分别为试验1～4在290 nm测得的吸光度（第1个试管测得的OD值以第3个试管为空白对照测得；第2个试管的OD值以第4管为空白对照测得）。

表1 黄嘌呤氧化酶活性抑制试验反应体系

1.2.4 抑制常数的测定

在5 mL反应体系中，黄嘌呤氧化酶酶液浓度固定为0.05 U/mL，底物黄嘌呤的浓度分别为0.3和0.6 mmol/L，测定不同浓度辣木叶提取物酶解的反应初速度。以提取物浓度作横坐标，反应初速度的倒数1/V为纵坐标，作Dixon图，求抑制常数Ki值。

1.2.5 抑制类型的测定

在5 mL反应体系中，黄嘌呤氧化酶酶液浓度固定为0.05 U/mL，底物浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L。测定辣木叶提取物质量浓度为0和5 mg/mL开始酶解的反应初速度。以1/[S]为横坐标，反应速率的倒数1/V为纵坐标，作Lineweaver-Burk双倒数图，推断出抑制类型。

2 结果与分析

2.1 不同乙醇体积分数提取所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

由图1可知，乙醇体积分数在40%～70%之间时，抑制率随乙醇体积分数增大而逐渐变大；乙醇体积分数达到70%时，抑制率达到最大；乙醇体积分数超过70%后，抑制率随乙醇体积分数增大呈下降趋势。原因可能是乙醇溶液体积分数较低，不能把辣木叶中的有效成分完全提取出来，而乙醇溶液的体积分数过高可能导致细胞蛋白质变性，从而妨碍乙醇向植物细胞渗透，影响有效成分的浸出，故抑制率下降。故选定最适乙醇体积分数范围为60%～80%。

图1 不同乙醇体积分数所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

2.2 不同提取时间所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

由图2可知，抑制率随提取时间呈现先上升再下降趋势，提取时间900 s时抑制率达到最大。原因可能是提取时间过短，辣木叶中的有效成分未被完全提出来，从而导致抑制率随着反应时间延长呈现逐渐上升的趋势。提取时间900 s时，辣木叶中有效成分基本被完全提取，故抑制率达到最大。继续延长提取时间，提取出的有效抑制活性成分被破坏或被氧化分解，使得抑制率呈现下降趋势。

图2 不同提取时间提取所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

2.3 不同料液比提取所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

由图3可知，料液比在1∶10～1∶40（g/mL）时，抑制率随料液比增大而增大；料液比1∶40（g/mL）时，抑制率达到最大；料液比超过1∶40（g/mL）时，抑制率随料液比增大逐渐下降。原因可能是料液比小于1∶40（g/mL）时，料液比及浓度梯度越大，有效成分溶出越多，抑制作用逐渐增强；当料液比为1∶40（g/mL）时，有效成分可能被完全提出，抑制率达到最大，已达到平衡；达到平衡之后，再增大料液比，浸出物变化不明显。

图3 不同料液比提取所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

2.4 不同温度提取所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

由图4可知，提取温度在40～70 ℃之间，温度越高，抑制率越高；温度达到70 ℃时，抑制率达到最大；在70～80 ℃范围内，抑制率随提取温度升高呈下降趋势。原因可能是温度在40～70 ℃范围内，温度升高加快乙醇的冷凝回流，导致辣木叶有效成分的提取速率增加，提取效果明显提高，故抑制率逐渐上升；提取温度70 ℃时，有效成分可能被完全提取出，抑制率达到最大；提取温度超过70 ℃时，提取物中有效活性成分被高温氧化，导致提取效率降低，从而导致抑制率下降。

图4 不同温度提取所得提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响

2.5 正交试验

根据单因素的结果，设计L9(34)正交表[11-12]，以提取液对黄嘌呤氧化酶的抑制率作为评价标准，进行正交试验，正交设计如表2，结果如表3所示。

表2 正交设计因素水平表

表3 辣木叶提取物对黄嘌呤氧化酶活性抑制影响正交表

由表3可知，各因素的主次顺序依次为B＞C＞A＞D，且最优的组合为B2C2A2D2，在此条件下进行3次平行验证试验，平均抑制率为79.81%，RSD值为0.66%。

2.6 辣木叶提取物对黄嘌呤氧化酶的影响

2.6.1 抑制常数的测定

Ki值是表征辣木叶提取物对酶促反应抑制效率的重要参数，该值越小，表明辣木叶提取物对该酶促反应抑制效果好。由图5可知，在底物浓度0.3 mmol/L和底物浓度0.6 mmol/L，改变提取物浓度，得出其对反应速度的影响曲线交点横坐标的绝对值为6.76，所以辣木叶乙醇提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制常数Ki=6.76 mg/mL。

图5 辣木叶提取物的黄嘌呤氧化酶反应Dixon

2.6.2 抑制类型的测定

存在有竞争性抑制剂时，Km’会增大，Vmax’不变。从图6可以看出，辣木叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用符合竞争性抑制的特征。竞争性抑制作用是最为常见的一种抑制类型，往往是酶的底物类似物或者是反应产物，竞争性抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同。

通过和底物黄嘌呤竞争黄嘌呤氧化酶的结合部位，影响它们的正常结合，从而抑制黄嘌呤氧化酶的活性，进而减少尿酸的生成。提取物浓度变大时，其抑制率也将变大。

图6 加辣木叶提取物后黄嘌呤氧化酶的Lineweaver-Burk图

3 结论

采用超声波辅助提取获得辣木叶的乙醇提取物，在单因素试验的基础上进行正交试验优化，即最佳工艺条件为：乙醇体积分数70%、提取时间900 s、提取温度70 ℃、料液比1∶40（g/mL）。在此条件下，辣木叶提取物对黄嘌呤氧化酶活力的抑制率为79.81%。

辣木叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制类型为竞争性抑制，抑制常数Ki=6.76 mg/mL，半抑制浓度IC50=10.55 mg/mL。