响应面法优化山楂多糖的闪式提取工艺

李丽，袁建琴，唐中伟，王文斌

山西农业大学生命科学学院（晋中 030801）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）是蔷薇科植物属落叶乔木，可消食，可促进胃分泌较多的胃消化酶；其提取物能降低血液黏度、提高心肌的供氧和供血能力，增强心脏功能、降低血压、抗心律失常等[1-8]。多糖一般是由成百上千，通过糖苷键连接的单糖形成的，具有较多的生物活性。有关研究表明，一些活性多糖具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤及调血脂等作用[9]。唐礼可[10]的研究表明山楂中的多糖可以提高动物机体的耐缺氧能力且能提高运动负荷的适应能力。

目前，多糖的提取方法有微波法、离子交换法、超声辅助法等[11]，闪式提取法利用机械剪切刀对药物进行切割，并进行搅拌，随着提取物颗粒的逐渐变小，提取液与药材颗粒间的化学组分在破碎的过程中分布并且在平衡和不平衡之间快速来回转换，最终彻底破碎，达到完全平衡[12-14]。同时，利用超速动态分子的渗透作用，使已经剪碎的物质与溶剂分子作用，最终从药材中分离出来，进入到提取液中，从而实现提取活性成分的目的。闪提技术具有操作简单，用时少，提取液的用量少，使用起来安全可靠等优点。

通过3个不同的单因素试验，研究其对多糖提取率的影响，并在响应面的分析软件中确定出其最优组合，以得到多糖的最高提取率。该试验为山楂资源的工业化和产业化提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂鲜果实（市售）；葡萄糖标准品、无水乙醇、6%苯酚溶液、浓硫酸；试验用水为蒸馏水。

1.2 试验器材

JHBE-50T中草药闪式提取器（河南智晶生物科技）；SBZ-019中草药粉碎机（天津泰斯特）；数显股份干燥箱（上海博讯实业）；标准筛（淄博史克制药设备制造）；7200-型分光光度计（尤尼柯仪器）；抽滤真空泵（郑州市亚荣仪器）。

1.3 试验方法

1.3.1 材料的处理

将新鲜山楂洗净，去掉核，果肉置于60 ℃烘箱中烘至恒重并用粉碎机粉碎，过筛（孔径0.18 mm），将粉末放入洁净干燥的玻璃瓶中，并将其密封，备用。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的建立[15-16]

取1 g干燥至恒重的葡萄糖粉末，定容到1 000 mL的容量瓶中，颠倒摇匀，配制得到1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。从中量取0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL的溶液于5支干燥洁净的试管中，并全部补水至1 mL，得到质量浓度为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别依次加入1 mL 6%的苯酚溶液和5 mL的浓硫酸，振荡，沸水浴15 min，迅速冷却至室温，以实验室使用的蒸馏水作对照，置于540 nm下的分光光度计中测吸光度。

1.3.3 多糖的测定方法[17]

吸取0.2 mL已制备好的多糖溶液于干燥洁净的试管中，加入0.8 mL的蒸馏水，采用和标准曲线相同的制作方法测定样品吸光度A，按式（1）计算相应浓度C。

式中：C为稀释后溶液的质量浓度，mg/mL；m为称量的山楂粉质量，mg。

1.3.4 液料比[15-16]

称取4份1 g的干燥山楂粉，放入4个蓝盖瓶中，按液料比30∶1，40∶1，50∶1和60∶1（mL/g）加入蒸馏水，用保鲜膜和橡皮筋封住瓶口，摇匀，在提取电压为100 V、提取时间为90 s的条件下进行闪式提取，将闪提后的物质置于干燥的大离心杯中，按5 000 r/min离心15 min，取出其上清液进行抽滤，将滤液旋转蒸发浓缩至3 mL，转移至15 mL的离心管中，加入4倍体积的无水乙醇进行沉淀，放入4 ℃冰箱，12 h后取出离心管，将管中物质进行抽滤，置于60 ℃烘箱中将抽滤后得到的多糖进行干燥，取出后转移至50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，摇匀。后续步骤同1.3.3中多糖的方法进行测定，并重复3次试验，取其平均值。

1.3.5 提取电压

称取4份1 g的干燥山楂粉，放入4个蓝盖瓶中，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸馏水，用保鲜膜封住瓶口，摇匀，在提取时间为90 s、电压分别为90，100，110和120 V的条件下进行闪式提取，后续步骤同1.3.4。

1.3.6 提取时间

称取4份1 g的干燥山楂粉，放入4个蓝盖瓶中，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸馏水，用保鲜膜封住瓶口，摇匀，在提取电压为110 V，提取时间分别为80，90，100和110 s的条件下进行闪式提取。后续步骤同1.3.4。

1.3.7 响应面设计试验

为了得到最优的因素组合，在Design-Expert 8.0.6分析软件中设定液料比（A）、提取电压（B）和提取时间（C）这3个因素的水平[18]。如表1所示。

表1 响应面分析的因素和水平

2 分析与结果

2.1 葡萄糖标准曲线的建立

如图1所示，葡萄糖标准曲线为Y=1.366X-0.027 1，R2=0.991 6，表明线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线的建立

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对山楂果肉中多糖提取率的影响

由图2可知，随着液料比的增加，溶液浓度减小，山楂果肉中提取到的多糖显著增加，当液料比为40∶1（mL/g）时，果肉中的多糖得率达到最大值，但随着液料比例的继续增加，多糖得率有所减少。由此确定，液料比40∶1（mL/g）是提取多糖的最优条件。

图2 液料比对得率的影响图

2.2.2 提取电压对山楂果肉中多糖提取率的影响

由图3可知，在100～110 V电压下，多糖得率有所上升；在110 V时，多糖得率达到最大值；超过110 V后，得率显著减少。由此确定，提取电压110 V是多糖提取的最佳电压。

2.2.3 提取时间对山楂果肉中多糖提取率的影响

由图4可知，随着时间延长，多糖得率增多；当时间为90 s时，多糖得率最多；再随着时间的增加，得率下降。由此确定，时间90 s是提取山楂多糖的最佳时间。

图3 提取电压对得率的影响图

图4 提取时间对得率的影响图

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面回归模型的建立与分析

用响应面分析软件，建立15种组合，并通过试验得到不同组合下的多糖得率，结果见表2。对回归模型的方差分析，结果见表3。

由表3中的p值可知，此方程模型是显著的，失拟项比F值不显著，方程的F=34.30，p＜0.05，表明二次方程拟合极显著；A、B、C、BC、A2、B2、C2的p值均小于0.05，呈显著水平，而AB、AC的p＞0.05，是不显著的。所以在这个试验中，各种因素对山楂果肉多糖提取率的影响由大到小依次为提取电压＞提取时间＞液料比。

表3 回归模型方差分析

2.3.2 响应面分析结果

由图5～图7可知，3种因素间的互作用对多糖的提取均有影响，每个因素均有双向增加的现象。

图5 液料比和提取电压的交互图

图6 液料比和提取时间的交互图

图7 提取电压和提取时间的交互图

由图7的3D可知，提取电压-提取时间交互作用的倾斜度最大，曲线较陡，因此山楂果肉中多糖的提取率受提取电压-提取时间的影响最大；由图6的3D图可知，液料比-提取时间交互作用的倾斜率较小，曲线较缓，所以多糖得率受液料比-提取时间的影响次之；由图5的3D可知，液料比-提取电压的倾斜度最小，曲线较平滑，所以多糖得率受液料比-提取电压的交互作用影响最小。

3 结论与讨论

选择合适的液料比、电压和提取时间可以获得较高的山楂多糖的提取率，根据响应面分析法建立的各种单因素的最优试验条件是：液料比42∶1（mL/g），提取电压105 V，提取时间86 s。在此理论下测得多糖的得率为6.63%，而软件预测值为6.67%，对比相差0.04%。由此可见，试验模型选择合理，具有实用价值。

闪式提取中在以液料比为单因素的试验中，液料比在达到40∶1（mL/g）后，再随着液体的增多，得率减少，其原因可能是提取时的液体较多，浓度相对减小，导致刀片与山楂的剪切率下降，使山楂中多糖的有效成分提取不完全；也可能是其他物质的溶出而抑制了多糖的提取[19]；在以提取电压为单因素的试验中，当电压为110 V时，得率达到最大值，之后电压增大，提取率减少，其原因可能是在高速电机的带动下，内外刀在高速旋转的过程中影响了某一部分多糖的内部结构，导致得率减少；在以提取时间为单因素的试验中，当时间达到90 s时，得率最高，随着时间的延长，其得率降低，其原因可能是在提取的过程中刀头不断剪切，本就可以产生较多热量，继而随着提取时间的延长，溶液温度升高很快，不稳定的化学成分易发生变化[20-21]。

由此次试验可知，闪式提取可得到山楂果肉中的多糖，且闪式提取与超声辅助法提取技术相比，闪提法得率为6.63%，而超声辅助法得率为1.85%[22]；闪式提取法与微波法相比，微波法的提取率为1.53%，得率比闪提法的得率低，且尽管微波法的时间相对其他方法时间相对要短，但闪式提取只需要90 s，时间比微波法3 min的时间更短[15]。相比之下，闪式提取法速度快，省时，能大大提高提取率，是一种高效提取山楂多糖的方法。