以蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性评价淡豆豉发酵工艺

王萍，陈丽艳，孙银玲，任善崇，曹阳，王伟明

黑龙江省中医药科学院（哈尔滨 150036）

淡豆豉是以大豆为原料，以青蒿、桑叶为辅料，经发酵加工而成的药食同源类中药。淡豆豉的发酵过程中有多种微生物共同参与而产生多种酶，其中，蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性是衡量淡豆豉品质的重要指标。蛋白酶可将大豆中的蛋白质水解成肽类和游离氨基酸等小分子，提高生物活性和利用度[1-2]；β-葡萄糖苷酶可将基质中的异黄酮糖苷水解成游离型苷元而被人体吸收利用[3-4]。淡豆豉的传统生产工艺为自然发酵，受生产环境、季节等因素的影响导致品质不稳定、工艺不可控，也易受到有害菌污染，如产生引起人、畜肝脏致癌的黄曲霉毒素等，引起医药界的广泛关注[5]。因此，采用纯菌种发酵制备淡豆豉，考察淡豆豉动态发酵过程蛋白酶和β-葡萄糖苷酶的活性变化，筛选淡豆豉的最佳制备工艺，为保证淡豆豉品质及用药的安全有效提供依据。

1 材料与发放

1.1 菌种来源

淡豆豉（批号170701，黑龙江德顺长中药饮片有限公司；批号170402，山东舜生堂中药饮片有限公司）。试验采用前期从市售淡豆豉中分离的优势菌种，命名为SSP-I和SSP-II。经鉴定，SSP-I是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），SSP-II是伞枝梨头霉（Absidia corymbifera [John] Saccardo Trotter）。另一株是标准菌株米曲霉（CICC 2014Aspergillus oryzae，中国工业微生物菌种保藏中心[6]）。

1.2 材料与试剂

福林酚试剂（批号20170218，北京博奥拓达）；酪蛋白CS（批号20161108，北京博奥拓达）；酪氨酸Tyr（批号20170612，北京博奥拓达）；对硝基苯酚P-NP（批号20171104，上海山浦化工有限公司）；碳酸钠（批号20171012，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.3 主要仪器与设备

电子天平（BSA224S，赛多利斯）；电热恒温培养箱（DHP-9272，上海一恒科学仪器有限公司）；冻干机（LGJ-10F，北京松源华兴科技发展有限公司）；离心机（LG10-2.4A，北京京立离心机有限公司），多功能酶标仪（M200，TECAN）。

1.4 方法

1.4.1 淡豆豉的制备

1.4.1.1 发酵菌液的制备

将SSP-I菌接种于营养琼脂试管斜面上，于37 ℃培养18～24 h。将SSP-II菌和CICC2014菌分别接种于PDA试管斜面上，于28 ℃培养3～5 d。用无菌生理盐水将斜面上菌落冲洗混匀制成菌悬液，浓度109CFU/mL，备用[7]。

1.4.1.2 发酵工艺

取青蒿7 g、桑叶10 g，加水煎煮，滤过，煎煮液拌入100 g净大豆中，待吸尽后，装袋，121 ℃高压灭菌40 min，放凉，备用[14]。按表1分别接种1.4.1.1的菌液1 mL，摇匀，先于37 ℃培养7 d（前酵），平行样品各取出一份，另一份移置42 ℃[8-11]培养15 d（后酵），取出，备用。具体发酵条件见表1。

表1 不同菌种发酵淡豆豉前酵、后酵温度及发酵时间

1.4.2 淡豆豉蛋白酶活性测定

1.4.2.1 酪氨酸标准溶液配制

酪氨酸（Tyr）在105 ℃干燥至恒质量，精密称取0.1 g，加1 mol/L HCl溶液6 mL溶解，0.2 mol/L HCl溶液定容至100 mL容量瓶，得100 μg/mL Tyr标准储备液。精密吸取标准溶液，分别稀释为80，60，40和20 μg/mL Tyr标准溶液，得线性范围为20～100 μg/mL的质量浓度梯度标准溶液。Tyr标准溶液各40 μ L，加入0.4 mol/L Na2CO3溶液200 μL后，加福林酚试剂40 μL，40 ℃水浴20 min，采用多功能酶标仪于660 nm测定OD值[12-13]。

1.4.2.2 供试品溶液制备

精密称取淡豆豉10 g，加无菌生理盐水50 mL，研磨，离心15 min，2次，上清液作为供试品溶液[14]。精密吸取取供试品溶液和0.02 g/mL酪蛋白（CS）溶液各50 μL，40 ℃水浴2 min后混匀，水浴10 min，加入三氯乙酸（TCA）溶液100 μL，混匀，40 ℃水浴20 min，离心。取上清液40 μL加0.4 mol/L Na2CO3溶液200 μL，混匀，加福林酚试剂40 μL混匀，40 ℃水浴20 min，测定OD值。

1.4.2.3 空白对照溶液制备

取淡豆豉供试品溶液50 μL，勿加酪蛋白（CS）溶液，其他处理同1.4.2.2。

1.4.3 淡豆豉β-葡萄糖苷酶活性测定

1.4.3.1 对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷溶液的配制

精密称取对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（P-NPG）30.13 mg，加0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至100 mL容量瓶，得1 000 μmol/L P-NPG溶液。

1.4.3.2 对硝基苯酚标准溶液的配制

精密称取对硝基苯酚（P-NP）1.39 mg，加0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至100 mL容量瓶，得100 μmol/L的P-NP标准溶液。精密吸取P-NP标准溶液，分别稀释为10，20，30，40，50和60 μmol/L标准溶液，得线性范围为10～100 μmol/L的浓度梯度标准溶液。于400 nm测定OD值。

1.4.3.3 供试品溶液制备

精密吸取P-NPG溶液120 μL，45 ℃水浴5 min，加入1.4.2.2的淡豆豉供试品溶液30 μL，45 ℃水浴10 min，加入1 mol/L Na2CO3溶液150 μL中止反应，于400 nm下测定OD值。

1.4.3.4 空白对照溶液制备

精密吸取1.4.2.2的淡豆豉供试品溶液30 μL，45℃水浴10 min，加入1 mol/L Na2CO3溶液150 μ L中止反应，于400 nm下测OD值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

1个酶活力单位是指在特定条件（25 ℃，其他为最适条件）下，在1 min内能转化1 μ mol底物的酶量，或是转化底物中1 μmol的有关基团的酶量[15-17]。结果见图1。

经分析得到蛋白酶标准曲线为Y=0.005 8X+0.073 9（R2=0.994 1），表明Tyr质量浓度20～100 μg/mL呈良好线性关系。

经分析得到β-葡萄糖苷酶活的标准曲线为Y=0.007 6X+0.059 2（R2=0.998 6），表明P-NP浓度10～100 μmol/L呈良好线性关系。

图1 蛋白酶标准曲线

图2 β-葡萄糖苷酶标准曲线

2.2 淡豆豉蛋白酶活性测定结果

根据线性回归方程及样品的OD值，计算出按表1发酵条件所得到的淡豆豉样品的蛋白酶活性，结果见图3和图4。

图3 黄豆前酵和后酵蛋白酶活性动态变化趋势图

图4 黑豆前酵和后酵蛋白酶活性动态变化趋势图

单菌种发酵样品蛋白酶活性测定结果表明，1号菌接种至黑豆发酵13 d，酶活为1 590.24 IU/g，接种至黄豆发酵10 d，酶活为1 379.00 IU/g；2号菌接种至黑豆发酵19 d，酶活为1 182.82 IU/g，接种至黄豆发酵16 d，酶活为1 035.06 IU/g；3号菌接种至黑豆发酵7 d，酶活为1 040.33 IU/g，接种至黄豆发酵7 d，酶活为818.25 IU/g。即采用1号菌、以黑豆为基质发酵制备淡豆豉蛋白酶活性最高，但以黑豆为发酵基质的淡豆豉蛋白酶活性与黄豆相比，降低了211.24 IU/g，如从成本考虑亦可采用黄豆为基质发酵。

双菌种发酵样品蛋白酶活性测定结果表明，4号菌分别接种至黑豆或黄豆发酵19 d，酶活分别为1 152.51和996.83 IU/g；5号菌接种至黑豆发酵3 d，酶活为1 249.53 IU/g，接种至黄豆发酵16 d，酶活仅为673.22 IU/g；6号菌接种至黑豆发酵10 d酶活达1 050.27 IU/g，而接种至黄豆发酵22 d，酶活为791.25 IU/g。由此可知，双菌种组合发酵制备淡豆豉，黑豆作为发酵基质优于黄豆，采用5号菌最佳。

因此，以蛋白酶活性为考察指标确定淡豆豉的最佳工艺为：以黑豆为基质，枯草芽孢杆菌为发酵菌种，于37 ℃前酵7 d，于42 ℃后酵6 d。

2.3 淡豆豉样品β-葡萄糖苷酶活性测定结果

根据标准曲线及样品的OD值，计算出按表1发酵条件所得到的淡豆豉样品中的β-葡萄糖苷酶活性，结果见图5和图6。

图5 黄豆前酵和后酵动态β-葡萄糖苷酶活性变化趋势图

图6 黑豆前酵和后酵动态β-葡萄糖苷酶活性变化趋势

单菌种发酵样品β-葡萄糖苷酶活性结果显示，1号菌接种至黑豆发酵19 d，酶活为23.39 IU/g，接种至黄豆发酵22 d，酶活为7.84 IU/g；2号菌接种至黑豆发酵13 d，酶活为27.96 IU/g，接种至黄豆发酵19 d，酶活为19.70 IU/g；3号菌接种至黑豆发酵19 d，酶活为16.41 IU/g，接种至黄豆发酵22 d，酶活为11.69 IU/g。即黑豆作为发酵基质优于黄豆，2号菌种最佳。

双菌种发酵样品β-葡萄糖苷酶活性结果显示，4号菌分别接种至黑豆和黄豆发酵22 d，酶活分别为7.94和11.15 IU/g；5号菌接种至黑豆发酵7 d，酶活为12.22 IU/g，接种至黄豆发酵10 d，酶活为23.80 IU/g；6号菌接种至黑豆发酵10 d，酶活为47.15 IU/g，接种至黄豆发酵22 d，酶活为16.59 IU/g。即黑豆作为发酵基质优于黄豆，6号菌种最佳。

因此，若以β-葡萄糖苷酶活性为衡量指标，淡豆豉最佳发酵条件为：以黑豆为基质，以伞枝梨头霉和米曲霉双菌种为发酵菌种，于28 ℃前酵7 d，经42 ℃后酵3 d。

3 讨论

3.1 酶活性对淡豆豉的影响

淡豆豉含有大豆异黄酮类、大豆低聚糖、大豆皂苷、大豆多肽、褐色素、γ-氨基丁酸、豆豉纤溶酶等成分，具有广泛的药理作用[18-20]，淡豆豉异黄酮中糖苷型异黄酮是由游离型异黄酮与一分子的葡萄糖以7-位氧苷键结合的产物，天然苷类的分子结构并不是其活性发挥的最佳状态，需在肠道微生物的作用下转化为苷元被吸收利用，而淡豆豉在炮制过程中，在β-葡萄糖苷酶的作用下，就能够使糖苷型异黄酮的葡萄糖基团脱掉，由结合糖苷型转化为游离型苷元[21-23]；淡豆豉中的大豆多肽多是指以大豆为原料经Aspergillus oryzae、Bacillus subtilis等微生物产生的蛋白酶作用下分解为多低聚肽类物质，通常由3～6个氨基酸组成，还包括一些游离氨基酸、少量糖类等[24]。因此β-葡萄糖苷酶和蛋白酶的活性作为其发酵过程控制指标，具有重要意义，故试验采用2种酶活作为淡豆豉品质的衡量指标，经研究得到活性较高的淡豆豉的纯菌种发酵条件，为多功能型淡豆豉的生产提供依据。

3.2 发酵基质与菌种对淡豆豉的影响

传统的淡豆豉制备多采用黑豆作为发酵基质，而纳豆、天培等具有保健作用的大豆发酵食品是以黄豆作为发酵基质来制备[25]。《药典》中规定为大豆，并未明确黑豆或黄豆等，因此本研究对比考察黑豆、黄豆发酵制备淡豆豉，结果发现，黑豆作为发酵基质稍优于黄豆，同一菌种、不同发酵基质制备淡豆豉蛋白酶活性变化趋势基本一致，但β-葡萄糖苷酶活性的变化趋势相差较大，尚需进一步研究。菌种是中药发酵的基本工具，也是决定发酵产品品质和疗效的关键影响因素。不同菌种产生的酶系及活性不同，对发酵基质营养物质的利用及对活性物质的转化能力也所差异。由试验结果可知，产蛋白酶活性高的菌种在发酵过程中对大豆蛋白的降解能力越强，产β-葡萄糖苷酶活性高的菌种对糖苷类异黄酮水解能力越强。传统的淡豆豉自然发酵法中的多菌种能够产生丰富酶系，可促进代谢产物的多级转化[26-28]。试验仅以2种酶活性为指标考察单、双菌发酵的淡豆豉工艺，对于发酵前后大豆蛋白和大豆异黄酮糖苷成分的转化机制将作为后续研究课题。

4 结论

试验以枯草芽孢杆菌为发酵菌种，以黑豆为基质制备的淡豆豉，最佳发酵条件为，先经37 ℃发酵7 d，经42 ℃发酵6 d，蛋白酶活性较高，为1 590.24 IU/g，与黄豆基质的差异不显著。黑豆为基质，以伞枝梨头霉和米曲霉作为联合发酵菌，最佳发酵条件为，先经28 ℃发酵7 d，经42 ℃发酵3 d，β-葡萄糖苷酶活性达到47.15 IU/g，优于黄豆基质。发酵菌种、基质和条件不同，对淡豆豉的品质影响较大。多菌种联合发酵对品质提高具有实际意义。