反向离子对高效液相色谱-电感耦合等离子质谱联用分析富硒食品中硒的形态

黄韬睿，王鑫，王小平

(1.四川旅游学院 烹饪学院，成都 610100；2.四川省食品药品检验检测院，成都 610097)

硒是人体必需的微量元素，具有抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力等显著的生理功能，所以维持机体中适量的硒水平能预防多种疾病，如癌症、克山病、大骨节病等[1]。然而，从世界卫生组织公布的数据来看，全球存在普遍缺硒的问题，40多个国家和地区处于低硒或缺硒的状态[2]。目前人们可通过多种途径补充硒元素，如药物、硒营养强化剂、膳食补硒等，其中通过食物补硒是最便捷的方法，也是最值得推崇的方法，因此诸如富硒大米、富硒小麦、富硒酵母、富硒平菇、富硒灵芝、富硒土豆、富硒猪肉、富硒酸奶等富硒食品的研究和开发成为人们关注的热点[3]。硒元素毒性与营养的阈值范围极窄，国际学术组织联合会(FAO/WHO/IAEA)建议成年男女膳食硒适宜需要量分别为40 μg/d和30 μg/d[4]。长期食用低于0.1 mg/kg的含硒食物会导致人体硒缺乏反应症，长期食用硒高于1 mg/kg的食物则会引起硒中毒[5]。硒元素在食品中的形态主要分为无机硒和有机硒，无机硒主要包括单质硒、硒酸盐、亚硒酸盐、挥发态的甲基硒和硒化氢[6]，有较大毒性。有机硒主要为大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物，大分子硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等，小分子硒化物包括硒甲基硒半胱氨酸、硒代高胱氮酸、硒代蛋氨酸和硒肽等。有机硒毒性远低于无机硒，生物活性更高，富含营养，更有利于人体吸收[7]。

目前绝大多数食品标准中涉及到的硒都是总硒含量，但是这对于食品中硒的营养和毒性分析是远远不够的。市面上富硒产品越来越多，为了消费者能够吃上真正的富硒食品，享受硒元素的保健效果，建立快速、灵敏、准确的方法检测食品、药品及保健品等产品中的硒含量以及对硒元素形态进行分析对人类的健康和经济发展有着重要意义[8]。

而要实现食品中不同硒元素形态的分析，首先必须建立食品中硒化物的提取、分离和检测方法。目前，食品中硒化物的提取方法主要有水提取法、酸提取法、酶提取法、固相萃取法等[9-16]，也有使用氢氧化钠、Tris-盐酸缓冲液等作为提取剂的提取方法[17,18]。由于食品中硒形态的复杂性和多样性，目前所发展的测定技术对无机硒的形态分析较为成熟，而对有机硒的形态分析方法在测定实际样品时还要进一步完善。为此，需将各种分离方法和检测技术进行有机结合，并且期待联用技术的进一步发展[19]。硒化物分离检测的主流方法包括液相色谱与原子荧光联用法(HPLC-AFS)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS)、液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)、气相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(GC-ICP-MS)和电泳及其联用技术等[20-23]。本实验将运用酶解技术提取富硒食品中的硒化物并通过反向离子对高效液相色谱-电感耦合等离子质谱联用技术对富硒食品中硒酸根(SeO42-)、亚硒酸根(SeO32-)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)5种主要形态的硒化物进行分离和检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

硒酸根溶液Se4、亚硒酸根溶液Se6、硒代胱氨酸SeCys2(98%)、硒甲基硒代半胱氨酸MeSeCys(98%)、硒代蛋氨酸SeMet(98%)、胰蛋白酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶、磷酸二氢钾(色谱纯)、七氟丁酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)：美国Sigma公司；富硒酵母标准物质(产地：湖北恩施)；富硒茶(产地：湖北恩施)；富硒大米(产地：广西河池)；富硒矿泉水(产地：陕西安康)；富硒马铃薯(产地：湖北恩施)；富硒小米(产地：湖北恩施)。

1.1.2 仪器

Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色谱仪、SNO2355R iCAP RQ ICP-MS电感耦合等离子质谱仪、Hypersil GOLD C8反向色谱柱 美国赛默飞世尔公司；7DFE8C7A恒温振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；3K30离心机 美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 硒化合物的提取

本文使用在2018年6月21日发布的第一个关于食品中有机硒的国家标准GB 1903.28-2018《食品安全国家标准 食品营养强化剂 硒蛋白》中推荐的一种混合酶解提取硒化物的方法[24]：采用胰蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶在Tris-HCl缓冲液中37 ℃条件下振荡酶解36 h，经离心、截留大分子、过滤后上机，具体步骤见图1。

图1 硒化物提取流程图

1.2.2 标准溶液的制备

将5种标准溶液用去气水配制成空白、1，5，10，50 μg/L。

1.2.3 色谱条件及仪器参数

无机硒和硒代氨基酸的极性较强，在一般的C8或C18反相柱上保留很弱，不能实现有效分离，可以通过加入离子对试剂改善目标化合物在反相柱上的保留。实验采用Hypersil GOLD C8作为分离柱，磷酸二氢钾-七氟丁酸-甲醇-水体系作流动相，其中七氟丁酸作为离子对试剂，磷酸二氢钾作缓冲盐增加了离子强度，提高了流动相洗脱能力，运用Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色谱与iCAP RQ ICP-MS联用技术实现了5种Se形态的快速高效分离。iCAP RQ具有专利Flatapole碰撞反应池QCell，本实验使用单氦气作为动能歧视效应(KED)的碰撞气体，选择性地有效抑制了多原子离子对78Se+的干扰，同时能保持相联设备(HPLC-ICP-MS)的高灵敏度。实验中直接将柱子出口与雾化器相联完成仪器之间的联用。同时用通讯电缆连接到iCAP RQ ICP-MS的I/O面板，建立双向触发。使用Thermo Scientific Qtegra控制软件的tQuant功能实现全部定量分析(峰面积积分、浓度、校准曲线拟合等)。具体色谱条件及仪器参数见表1和表2。

表1 5种硒化物分离色谱条件

表2 检测仪器参数

1.2.4 标准曲线的制定

将1.2.2制备的5种硒化物同浓度标准溶液分别混合，按照1.2.3色谱条件及仪器参数进行分离检测，记录5种硒化物在不同浓度下的峰面积积分并分别制定标准曲线。

1.2.5 不同硒形态检出限测定

在空白样品中加入5 μg/L的混合标准溶液，以3倍基线噪音测定5种硒化物的检出限。

1.2.6 回收率测定

为了验证方法的准确度，选取富硒酵母标准物质(SELM-1)作为分析对象按照所确定方法检测其中硒代蛋氨酸含量，对照标准品证书标称含量计算方法回收率。

1.2.7 样品检测

选取市售富硒茶(样品1)、富硒大米(样品2)、富硒矿泉水(样品3)、富硒马铃薯(样品4)、富硒小米(样品5)5种样品进行硒元素含量检测和5种不同硒元素形态的分离检测，计算总硒的提取回收率，并对结果进行分析。

1.2.8 方法准确度验证

为了考察方法的准确度，向市售样品提取液中加入5种硒形态浓度同为38 μg/L的混合标准溶液，分别计算5种硒化物的回收率。

2 结果与分析

2.1 5种硒形态各浓度混合标准溶液色谱叠加图

将5种不同硒形态标准液混合物按照1.2.3色谱条件及仪器参数进行分离检测，将5种不同浓度标准混合液所得色谱图进行叠加，结果见图2。

图2 5种硒形态各浓度混合标准溶液色谱叠加图

由图2可知，本文所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hypersil GOLD C8，以七氟丁酸-磷酸二氢钾-甲醇-水为流动相等度洗脱，对5种硒形态的分离效果较好，采用常规粒径液相色谱柱实现了在800 s内完成5种硒形态的快速分离。

2.2 5种硒形态混合标准溶液的标准曲线

按照1.2.4制定5种不同硒化物的标准曲线，5种硒化物在0～50 μg/L范围内线性相关系数均为1.000，线性关系良好，见表3。

表3 5种硒形态标准曲线参数

2.3 检出限的测定

0.5 μg/L混合标准溶液色谱图见图3，各形态峰高均≥基线噪音的3倍，SeO42-、SeO32-、SeCys2、MeSeCys和SeMet的检出限可分别达到0.20,0.25,0.25,0.20,0.50 μg/L。

图3 0.5 μg/L混合标准溶液色谱图

2.4 回收率测定结果

按照1.2.6方法，测定富硒酵母标准物质(SELM-1)中硒代蛋氨酸结果及回收率，见表4。结果表明该法回收率高，回收效果好。

表4 富硒酵母标准物质测定结果

2.5 样品检测结果

选取市售富硒茶(样品1)、富硒大米(样品2)、富硒矿泉水(样品3)、富硒马铃薯(样品4)、富硒小米(样品5)作为样品进行硒元素含量检测和5种不同硒元素形态的分离检测，按照1.2所建立的方法，样品中5种硒元素形态均能实现有效分离，结果见表5。结果表明，本实验采用的混合酶解提取硒化物方法提取效率较高，能有效实现富硒食品中硒化物的提取，另外从结果中也可以看出5种富硒食品样本中硒种类与含量各不相同，其营养价值及利用度值得深入探究。

表5 样品检测结果

2.6 方法准确度验证结果

为了考察方法的准确度，向市售样品提取液中加入5种硒形态浓度同为38 μg/L的混合标准溶液，分别计算5种硒化物的回收率，结果见表6。结果表明，该方法对5种不同硒元素形态回收率好、准确度高。

表6 回收率验证结果

3 结论

本文建立了利用反向离子对高效液相色谱-电感耦合等离子质谱联用分离检测富硒食品中硒酸根(SeO42-)、亚硒酸根(SeO32-)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)5种不同硒元素形态的方法，其中采用胰蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶在Tris-HCl缓冲液中37 ℃条件下振荡酶解36 h提取食品中的硒化合物。结果表明：所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hypersil GOLD C8常规粒径液相色谱柱，以七氟丁酸-磷酸二氢钾-甲醇-水为流动相等度洗脱，实现了在800 s内完成5种硒元素形态的快速准确分析。通过市售富硒食品样品验证，该方法是一种有效可行的对富硒产品中硒形态的分析方法。硒元素对人体的保健功能越来越被重视，目前市面上的富硒食品种类也越来越多，此方法的建立将有助于对富硒食品中硒元素的形态和硒对人体的作用进行更深层次的研究，为国家食品监管部门建立更完善的富硒食品国家标准和富硒食品行业标准奠定了基础，使富硒食品市场变得更加规范，为消费者更好地选择和食用富硒食品提供了保障。