苏州地区耐左氧氟沙星无乳链球菌临床分离株分子及质谱学特征分析*

张宇蔺，苏宁，陈海鹏，秦国英，陆文香，徐卫东，袁栎，钟桥(.南京医科大学附属苏州医院医学检验科, 江苏苏州500；.南京医科大学生物化学与分子生物学系，南京66)

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)也被称为B族链球菌(group B streptococcus，GBS)，不仅可导致新生儿侵袭性感染[1]，亦可造成免疫力低下人群的感染[2]。青霉素为抗GBS感染治疗的首选药物，但对于青霉素过敏人群，临床常采用左氧氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物替代治疗。通过抑制细菌DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，左氧氟沙星可以影响细菌DNA复制、修复和重组，进而达到抑菌效果。细菌内DNA解旋酶或拓扑异构酶一旦发生突变，则可以导致喹诺酮类抗菌药物耐药[3]。鉴于此，本研究拟通过分析DNA解旋酶和拓扑异构酶等基因突变、血清型及多位点序列分型等，了解苏州地区GBS耐左氧氟沙星的机制及菌株流行特征；通过分析耐药菌株蛋白质谱特征峰，探讨蛋白质谱特征峰用于左氧氟沙星耐药菌株的快速鉴别能力。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集南京医科大学附属苏州医院2018年1月至2019年1月临床连续分离非重复GBS菌株132株，其中左氧氟沙星耐药菌株(LRGBS)58株，敏感菌株(LSGBS)74株。菌株来源于女性生殖道113株、新生儿胃液8株、血液3株、尿液3株、痰液及口咽拭子4株以及羊水1株。所有菌株经菌落形态、溶血特征、革兰染色观察后，采用BD Phoenix-100TM全自动微生物鉴定仪以及Bruker 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)仪进行鉴定，药敏试验采用其配套药敏系统检测，左氧氟沙星药敏结果判断依据2018年美国临床和实验室标准协会(CLSI)微生物药物敏感性试验标准。质控菌株无乳链球菌ATCC 12403(血清型Ⅲ型)以及大肠埃希菌ATCC 25922均为本室保存菌株。

1.2主要仪器及试剂 Phoenix-100TM细菌鉴定系统及配套试剂(BD公司)，MALDI-TOF MS鉴定系统及配套试剂(Bruker公司)，PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统以及GelDoc XR凝胶成像仪(Bio-Rad公司)，NanoDrop 1000超微量分光光度计(NanoDrop公司)；哥伦比亚血琼脂平板(郑州安图生物公司)，基因组DNA提取试剂盒(北京全式金公司)，Taq聚合酶、dNTP试剂以及核酸marker DL2000(日本TaKaRa公司)，琼脂糖(美国Sigma公司)，胶回收试剂盒(美国Axygen公司)，凝胶电泳指示剂GelRed(江苏博美达公司)，引物合成及测序由苏州金唯智公司完成。

1.3细菌基因组DNA提取及PCR扩增 用细菌基因组DNA试剂盒提取DNA，浓度经NanoDrop 1000超微量分光光度计检测并以吸光度比值(A260 nm/A280 nm)在1.6～1.9之间为宜。参考文献[4-5]合成DNA解旋酶(gyrA)、拓扑异构酶(parC和parE)以及血清型cps基因引物(见表1)。依据cps基因扩增产物大小可以分成不同血清型，其中Ⅰa型扩增产物长度分别为521 bp和1 826 bp，Ⅰb型扩增产物约为770 bp，Ⅱ型扩增产物约为397 bp，Ⅲ型扩增产物约为1 800 bp，Ⅳ型扩增产物约为578 bp，Ⅴ型扩增产物约为701 bp，Ⅵ型扩增产物约为487 bp，Ⅶ型扩增产物约为371 bp，Ⅷ型扩增产物约为282 bp，其余为未定型。PCR体系为20 μL，包括10×PCR缓冲液2 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板 1 μL(约50 ng)，ExTaq聚合酶0.5 U，ddH2O 13.2 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。阳性扩增产物送苏州金唯智生物公司采用ABI 3730XL自动测序仪进行Sanger双向测序，测序结果采用DNAstar Lasergene v7.1软件MegAlin模块，选择Clustal W算法进行多序列比对分析，并显示保守序列及保守性；Chromas软件分析主要突变位点。

1.4多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)分型 用PCR法扩增GBS 7个管家基因(adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcX和tkt)，引物序列(见表1)、反应体系及扩增条件均参照MLST网站(http://pubmlst.org/sagalactiae/)[6]。PCR产物纯化后进行基因测序，将序列数据提交MLST网站进行比对，获得管家基因组合编码，最终确定菌株序列分型(sequence typing,ST)。

1.5LRGBS菌株质谱特征峰鉴定及统计学分析 用甲酸萃取法提取GBS菌株蛋白质，使用Flex control软件采集GBS菌株蛋白质谱峰。比较LRGBS与LSGBS菌株间的蛋白质谱差异特征峰，将132株菌随机分成训练集和测试集，其中，训练集含有46株LRGBS和59株LSGBS，测试集含有12株LRGBS和15株LSGBS。用ClinProTools 3.0软件读取MALDI-TOF质谱峰数据，通过基线校正等质谱数据标准处理，计算信噪比≥5且质荷比在2 000～10 000 m/z之间的质谱峰峰面积及强度，分别计算2组间平均峰面积与峰强度比值(Ave)、标准差(s)以及变异系数(CV)等；正态性分布检验采用Anderson-Darling拟合优度检验，其P<1为非正态分布，而P>1为正态分布；2组间差异质谱峰比较采用t检验或Wilcoxon检验计算，以P<0.05为2组间差异峰具有统计学意义。

1.6模型建立及外部验证 用ClinProTools 3.0软件将筛选获得的差异蛋白质谱峰，用3种不同数据模型算法，即遗传算法(genetic Algorithm，GA)、监督神经网络算法(Supervised Neural Network，SNN)和快速分类算法(Quick Classifier，QC)，建立预测模型。用测试集27株GBS菌株质谱图谱对所建立的3个模型进行外部验证，以评估所建立模型区分耐左氧氟沙星菌株的敏感性和特异性。

表1 本研究所用引物序列信息

2 结果

2.1LRGBS菌株DNA解旋酶及拓扑异构酶基因突变 58株LRGBS菌株gyrA、parC及parE基因编码区测序结果显示：gyrA基因在第81位氨基酸发生突变，由野生型TCA编码丝氨酸(Ser)突变为TTA编码亮氨酸(Leu)，记为gyrA_Ser81Leu，突变率89.7%(52/58)，其余6株为野生型；parC基因第79位氨基酸发生突变，由野生型TCC编码丝氨酸(Ser)突变为TAC、TTC和GCC，分别编码酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和丙氨酸(Ala)，即parC_Ser79Tyr、parC_Ser79Phe和parC_Ser79Ala，突变率分别为60.3%(35/58)、20.7%(12/58)和13.8%(8/58)，其余3株为野生株；parE基因第225位氨基酸发生突变，由野生型CAT编码组氨酸(His)突变为TAT编码酪氨酸(Tyr)，即parE_His225Tyr，突变率为81%(47/58)，其余11株为野生株。见图1。基因突变模式汇总结果显示，58株LRGBS菌株中发生gyrA_Ser81Leu+parC_Ser79Tyr+parE_His225Tyr突变26株，占44.8%；其次为gyrA_Ser81Leu+parC_Ser79Phe+parE_His225Tyr突变11株，占18.9%。见表2。

注：A，为gyrA野生型；B，为gyrA突变株，其第81位氨基酸突变为Leu，编码基因为TTA；C，为parC野生型；D～F，为parC突变株，其第79位氨基酸分别突变为Tyr、Ala以及Phe，编码基因分别为TAC、TTC和GCC；G，为parE野生型；H，为parE突变株，其第225位氨基酸突变为Tyr，编码基因为TAT。

2.2LRGBS菌株血清型及MLST分型 58株LRGBS菌株检出血清型Ⅲ型32株，占55.2%；Ⅰb型15株，占25.9%；Ⅰa型6株，占10.3%；Ⅴ型4株，占6.9%；Ⅵ型1株。MLST分型显示,LRGBS分为ST19(34株，58.6%)、ST23(12株，20.7%)、ST1(5株，8.6%)、ST591型(5株，8.6%)以及ST17(2株，3.4%)。32株血清Ⅲ型菌株有29株为ST19型，占90.6%；15株血清Ⅰb型菌株有9株为ST23型，占60%。见图2。

表2 LRGBS菌株DNA解旋酶和拓扑异构酶基因突变及分型特征

注：M，DL2000 DNA marker；1，阴性对照；2，阳性对照 GBS ATCC 12403(Ⅲ型)；3～12，临床菌株，其中，3～4为Ⅰa型，5～6为Ⅰb型，7～10为Ⅲ型，11为Ⅴ型，12为Ⅵ型。

2.3LRGBS菌株质谱特征峰鉴定及验证 用ClinPro Tools 3.0软件进行对训练集2组间差异质谱峰统计结果显示，质核比为6 894、3 445、5 076、4 544以及3 721 m/z的峰为鉴别LSGBS与LRGBS间最主要的蛋白质谱峰，见表3。经Anderson-Darling拟合优度检验，发现上述几种差异蛋白质峰P值趋向0，提示非正态分布。用Wilcoxon检验来判断差异峰6 894、3 445、5 076、4 544以及3 721 m/z的P值均小于0.001，差异具有统计学意义。

用GA、SNN和QC 3种预测算法建立相应模型，并对测试集27株GBS进行外部验证计算。结果显示，采用GA算法模型，仅有2株LRGBS被错误地分类到LSGBS组，1株LSGBS被错误分类到LRGBS组。GA算法对GBS判断是否为左氧氟沙星耐药的敏感性达到90.9%，且特异性达87.5%，阳性预测值为83.3%，阴性预测值为93.3%。而SNN算法的敏感性仅为68.8%，特异性为90.9%；QC算法敏感性为56.3%，特异性为72.7%。

表3 LRGBS和LSGBS差异质谱峰统计结果

3 讨论

不同地区分离的GBS菌株对氟喹诺酮的耐药性存在较大差异。欧美国家分离GBS对氟喹诺酮较为敏感[7-8]，而亚洲国家如韩国、中国等分离株对氟喹诺酮耐药率较高，可达32.7%[9-10]。本研究表明，苏州地区临床分离GBS对左旋氧氟沙星耐药率高达43.9%。值得注意的是，欧美国家GBS对氟喹诺酮的耐药性也呈逐年递增态势。一项法国8 757株GBS菌株调查研究表明，2014年GBS对氟喹诺酮的耐药率比2007年增加7.5倍[7]。因此，调查本地区临床分离GBS菌株对氟喹诺酮的耐药性，明确其分子流行病学特征，对今后制定合理抗感染策略具有重要的指导意义。

DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ基因突变是介导GBS对氟喹诺酮耐药的主要机制[4]。本研究发现，LRGBS菌株gyrA和parE基因突变仅存在单一突变形式，即gyrA_Ser81Leu和parE_His225Tyr，突变率分别为94.8%(55株)和81%(47株)。然而，parC基因检出多种突变形式，但均在第79位氨基酸，即parC_Ser79Tyr、parC_Ser79Phe和parC_Ser79Ala，突变率分别为60.3%(35株)、20.7%(12株)以及13.8%(8株)。意大利一项研究[11]表明，仅parC_Ser79Phe突变的GBS菌株可引起低水平氟喹诺酮耐药，其对左氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)值为4 μg/mL，而同时具有gyrA_Ser81Leu和parC_Ser79Phe突变的GBS容易引起高水平耐药，其对左氧氟沙星的MIC值大于32 μg/mL。然而，本研究发现同时存在3种突变位点的GBS菌株占较大比例(77.6%，45株)，这提示其可能介导氟喹诺酮高水平耐药。

荚膜多糖是构成GBS不同血清型的物质基础，而血清型Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等为主要流行血清型[1,12]。本研究表明，苏州地区LRGBS菌株多为血清型Ⅲ型(32株)，其次为Ⅰb型(15株)，分别占比55.2%和25.9%。这与Wang等[10]报道我国分离的耐氟喹诺酮GBS菌株以血清型Ⅲ型为主有所不同，提示血清学分型存在着一定的地区差异。此外，法国报道耐氟喹诺酮GBS菌株多以血清型Ⅴ型为主[7]，而阿根廷以Ⅰb型为主[13]，我国大陆及台湾地区则多以Ⅲ型为主[10,14]，但MLST分型结果显示，多以ST19型为主。而本研究中发现，血清型Ⅲ型LRGBS菌株大多为ST19型，而血清Ⅰb型菌株多为ST23型。细菌群落分析可知，ST19型属于克隆复合体(clonal complex，CC)17型，而ST23则来源于CC23型。这提示本地区流行的LRGBS菌株主要存在2种不同克隆来源。

MALDI-TOF MS技术不仅用于菌种快速鉴定，还可就其采集的蛋白质特征峰进行细菌毒力、耐药性等特性快速判断。研究发现，高毒力ST17型GBS菌株在7 620 m/z处存在特征质谱峰，可以作为快速筛查标志[15]。而本研究发现，LRGBS菌株与LSGBS菌株相比，存在5种独特表达的差异特征峰，分别为6 894、3 445、5 076、4 544以及3 721 m/z。采用外部验证发现，GA算法建立的预测模型可对LRGBS进行快速鉴别，且具有较高的诊断敏感性和特异性。但仍需要进一步扩大测试菌株数量，以全面评估本研究筛选的差异特征峰在快速鉴别LRGBS菌株中的准确性。