3种稀释蝰蛇毒磷脂时间试验检测狼疮抗凝物的性能评价

寿玮龄，陈倩，范连凯，张建平，吴卫(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科，北京100730)

狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)是一组能直接与负电荷磷脂或磷脂蛋白复合物结合的免疫球蛋白，为抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，APA)中的一种[1]。LA可见于抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome，APS)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)及结缔组织病(connective tissue diseases，CTD)等多种疾病，与患者动静脉血栓和病态妊娠风险密切相关[2]。

现行LA的检测方法大多基于LA与磷脂结合可延长磷脂依赖的凝血试验时间这一原理，而活化部分凝血活酶时间(APTT)试验和稀释蝰蛇毒磷脂时间(diluted Russell viper venom time，dRVVT)试验为指南推荐和文献报道常用的检测方法[3-5]。本研究根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)文件和行业标准《临床血液学检测常规项目分析质量要求》(WS/T 406—2012)，评价3种不同dRVVT检测系统的性能是否满足临床检测需求[6-8]。目前，尚未见针对3种dRVVT试验检测系统结果一致性评价的相关研究报道，而3种检测系统推荐结果表达方式和试验流程亦不相同。本研究在分析不同检测系统间结果一致性的基础上，探讨不同检验流程对结果的影响。

1 材料与方法

1.1标本采集与处理 采集2019年11月至12月北京协和医院门诊、住院患者及体检健康者静脉血2.7 mL，与枸橼酸钠(109 mmol/L)抗凝剂按比例9∶1混匀，1 h内以离心力2 500×g离心10 min获得血浆样品，4 h内完成检测。血浆样品均无溶血、凝血、乳糜现象，血细胞比容<55%。本研究通过北京协和医院伦理学委员会批准(伦理号：ZS-2598)。

1.2主要仪器与试剂 系统1： 试剂Staclot®DRVV SCREEN/CONFIRM(批号254229/253933)、质控品及STA-R Evolution®全自动凝血分析仪由法国Stago公司提供；系统2：试剂dRVVT Screen/Confirm(批号：N0889953/N0688573)、质控品及ACL TOP 700全自动凝血分析仪由美国Instrumentation Laboratory(IL)公司提供；系统3：试剂LA1 Screening reagent/LA2 Confirmation reagent(批号：549993A/548866A)、质控品由德国Siemens公司提供，CS5100全自动凝血分析仪由日本Sysmex公司提供。

1.3方法

1.3.3携带污染率 取高值血浆样品1份，连续测定3次；再取低值血浆样品1份，连续测定3次。将测定结果记为H1、H2、H3和L1、L2、L3，计算携带污染率。携带污染率=|L1-L3|/(H3-L3)×100%。

1.3.4参考区间(RI)/cut-off值验证 收集40例表观健康人枸橼酸钠抗凝血浆样品，男20例，年龄22～60岁，女20例，年龄18～65岁。分别用3种系统检测LA水平，按照试剂说明书要求验证RI/cut-off值适用性。判断标准：40例验证数据与说明书RI/cut-off值比较，超出RI/cut-off值的检测数据个数≤10%时，验证通过。

1.3.5结果比对 收集136例枸橼酸钠抗凝血浆样品，男55例，女81例，年龄11～79岁。其中免疫系统疾病56例(APS 19例，SLE 24例，CTD等其他免疫系统疾病13例)、血栓性疾病12例，孕史不良4例，其他29例，健康体检者35例。暂以常规检测报告系统结果判定选择血浆样品，分别覆盖阴性、弱阳性、阳性和强阳性范围。在2 h内分别用3个不同系统检测LA水平，分析检测结果间一致性。

1.3.6不同检验流程结果分析 系统1和系统2说明书推荐同时进行LA筛选和确认试验，以标准化比值(NR)表示。系统3说明书推荐流程为：(1)LA筛查试验正常，提示LA阴性；(2)LA筛选试验延长，进行LA确认试验，检测结果以筛选/确认比值(R)表示。系统3分析136例血浆样品，采用说明书推荐流程以R为结果报告方式和同时进行筛选、确认试验以NR为结果报告方式的2种检测流程。

检测LA的筛选及确认试验直接用dRVVT试验测定的凝固时间(s)表示。NR=筛选比值/确认比值，筛选比值=筛选试验时间(s)/ 筛选试验正常均值(s)，确认比值=确认试验时间(s)/ 确认试验正常均值(s)。R=筛选试验时间(s)/ 确认试验时间(s)。

2 结果

2.1精密度 见表1、2。3种系统检测3个水平血浆样品LA水平，重复性以CV表示，为0.44%～1.69%；期间精密度以CV表示，为1.43%～2.43%。

表1 3种LA检测方法的重复性结果

表2 3种LA检测方法的期间精密度结果

2.2携带污染率 3种LA检测方法以NR为结果表示方式，携带污染率分别为1.03%、0.00%和0.91%；方法3以R为结果表示方式，携带污染率为0.91%，绝对值均小于3.00%。

2.3RI/cut-off值验证 系统1和系统2按照说明书以NR为结果表达方式，40例表观健康人血浆样品LA检测结果分别为0.89～1.15和0.87～1.20，RI/cut-off值验证通过。系统3检测按照说明书以R为结果表示方式，LA检测结果为1.02～1.29，其中7例超出1.20，验证不通过；若以NR为结果表示方式，LA检测结果为0.80～1.13，均在1.20以内。

2.4结果比对 见表3、4。不同系统间筛选试验、确认试验及比值结果差异均有统计学意义(P均<0.05)，系统3的2种不同结果表示方法间差异有统计学意义(Z=-10.128，P=0.000)。

以指南推荐NR≥1.20为阳性标准，3种系统检测136例血浆样品的LA阳性率分别为53.7%、65.4%、56.6%(系统3以NR为结果表示方式)和71.3%(系统3以R为结果表示方式)，差异有统计学意义(χ2=11.333，P=0.010)，其中系统3的 R结果阳性率高于NR结果阳性率。

表3 3种检测系统检测比对结果(n=136)

表4 3种检测系统阴阳性判断结果(n=136)[n(%)]

2.5不同检验流程结果分析 系统3按照说明书流程检测血浆样品LA水平，筛选试验正常共53例，其中2例NR结果分别为1.21和1.23，R结果分别为1.39和1.40，存在假阴性。系统1检测上述2例血浆样品LA水平，NR结果分别为1.22和1.20，系统2检测上述2例血浆样品，NR结果分别为1.32和1.24。

3 讨论

LA检测可分为以下3个流程：(1)筛选试验：磷脂依赖的凝血试验延长，提示可能存在循环抑制物；(2)1∶1混合试验：证实凝血时间延长不是由凝血因子缺乏导致；(3)确认试验：试剂中含高浓度磷脂，以证实循环抑制物具有磷脂依赖性[5]。

目前，国际指南均推荐基于凝血过程共同途径的dRVVT试验为LA首选检测方法之一，Thiagarajan等[9]于1986年首次报道了该方法。本研究验证3种不同系统dRVVT法检测性能，各系统重复性以CV表示，小于1.70%，期间精密度以CV表示，小于2.50%，与试剂说明书数据基本一致。WS/T 406—2012规定准确度验证应使用至少5份质评物，但因缺少标准物质，本次验证无LA检测的准确度数据。

各指南推荐以健康人群第97.5百分位数或第99百分位数设置RI/cut-off值。对于LA检测方法所提及cut-off值不同于根据ROC曲线所建立的cut-off值概念。系统3以R为结果表达方式时，RI/cut-off值验证未通过；提示各实验室需根据各实验室仪器及试剂对每一种LA检测方法建立或验证各实验室RI/cut-off值，包括纠正百分比等计算值[5,10-11]。

因试剂种类、磷脂构成和浓度、原理的不同，以及终点判断方式的不同等均会影响检测结果[12-13]。本研究比较不同系统间检测结果一致性并初步探讨不同流程间差异，提示临床对于LA结果解释需关注检测系统的差异。系统3中，R结果阳性率(71.3%)高于NR结果(56.6%)，筛选试验53例阴性血浆样品，2例按照NR表示结果分别为1.21和1.23，R结果分别为1.39和1.40，存在假阴性现象；提示实验室结合临床需求，对所采用检测系统说明书的推荐流程进行验证。

此外，LA检测对分析前质量控制要求严格[14]。对于以NR报告结果的检测方法，在更换LA试剂批号时需重新确定筛选试验和确认试验正常血浆均值。患者进行肝素、华法林及直接口服抗凝药等抗凝剂治疗时可产生假阳性结果[15-17]，3种试剂中均含有肝素中和成分，可中和0.8～1.0 IU/mL普通肝素，从而减少普通肝素对LA检测的影响。同时，LA可在感染、肿瘤和药物治疗患者中一过性出现，只有间隔12周且2次及以上检测LA仍存在，才能诊断抗磷脂抗体综合征[1]。因此，实验室应与临床医生进行及时有效的沟通，对患者的检测结果做出正确解释。