芦花鸡膜联蛋白A2 基因PCR 扩增

孙梦雪 张淑萍 郭延敏 张世超 王思琪 毛亚娟 姜莉莉*

（1，菏泽学院药学院 274015；2，菏泽市食品药品检验检测研究院 274000）

膜联蛋白A2 （ANXA2）是一种钙和脂结合蛋白，以钙依赖的方式结合磷脂和细胞骨架，可参与细胞分化，囊泡运输，胞膜运动等多种生理过程[1]。ANXA2 可与多种病毒的蛋白发生相互作用，影响病毒的组装、释放，对病毒增殖产生影响[2,3]。ANXA2 可作为HIV-1 感染的辅助因子，协助HIV-1 进入巨噬细胞；同时，ANXA2 还可作为HIV-1 Gag 蛋白的结合蛋白以及定位在内涵体膜上的Gag 蛋白积累辅助因子，对HIV 的正确组装至关重要[3]。Anx2 通过与胞膜上的HIV-1Gag 相互作用，在HIV-1 复制的后期发挥作用[2]。近几年研究表明ANXA2 能与病毒蛋白相互作用，影响病毒复制。鸡ANXA2 与禽流感病毒的NS1 蛋白相互作用，抑制宿主细胞凋亡，促进病毒增殖[4]，ANXA2 与H5N1高致病性禽流感病毒非结构蛋白NS1 相互作用，促进病毒的复制[5]。ANXA2 可与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）Nsp9 蛋白和波形蛋白相互作用，促进病毒复制[6,7]。AxnA2 的c 端结构域通过与牛流行热病毒(BEFV) 基质蛋白M 相互作用，介导M 蛋白在质膜上的定位，影响BEFV 复制[7]。本研究克隆鸡ANXA2 基因，并对其进行序列分析，为进一步对鸡ANXA2 基因功能及深入了解其抗病毒机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 引物设计

参考ncbi 中已发表的鸡ANXA2 基因序列 （登录号:NM_205351.1），设计ANXA2 基因扩增引物FA/RA，FA：5' -TGCCAACATGTCTACTGTC-3'；RA：5' -TCACAGCTTTCAGT CCTCTC-3'，引物由华大基因公司合成。

1.2 ANXA2 基因PCR 扩增

Trizol 法提取健康芦花鸡肝脏组织RNA 并反转录为cDNA。以提取的cDNA 为模板，用引物FA/RA 扩增ANXA2 基因。PCR 反应体系50μL:2×Taq PCR MasterMix 25μL，cDNA 模板1μL，上下游引物各2μL，ddH2O 20μL。PCR 反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35 个循环；72℃延伸10min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收产物送华大基因公司进行序列测定。

1.3 ANXA2 编码氨基酸序列理化特性分析

使用在线工具ProtParam 分析ANXA2 编码氨基酸理化特性。

2 试验结果

2.1 ANXA2 基因PCR 扩增

ANXA2 基因PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图所示，目的基因片段大约1000bp 左右，与预期结果一致。

附图 ANXA2 基因PCR 扩增结果

2.2 ANXA2 基因核苷酸序列分析

胶回收产物测序结果表明，扩增片段全长1036bp，用DNA Star 软件分析芦花鸡ANXA2 基因的核苷酸序列，结果表明，ANXA2 基因的CDs 区全长1020bp，理论分子质量为38.64KD，A （31.67%）、G （24.80%）、T （23.63%）、C（19.90%），（G+C）%为44.71%。

2.3 ANXA2 编码氨基酸序列理化特性分析

使用在线工具ProtParam 对ANXA2 的编码氨基酸序列分析，结果表明，ANXA2 分子式为C1701H2748N466O529S14，编码氨基酸中Ala (A) 数目最多，占总氨基酸数目的7.4%，N末端编码氨基酸是Ala (A)，该蛋白不含Trp 残基。整条肽链中疏水氨基酸的数目为109。该蛋白在哺乳动物网状细胞中半衰期为4.4h，在酵母菌中理论半衰期＞20h，在大肠杆菌中理论半衰期＞10h。该蛋白的不稳定指数为43.36，提示该蛋白为不稳定蛋白。脂肪系数为31.67，整条肽链中氨基酸亲水性的平均值为-0.502。

3 讨论

ANXA2 是一种钙依赖的膜结合蛋白，可以聚集含有磷脂的脂质筏，具有相当广泛地组织分布性，可存在于上皮细胞，巨噬细胞，单核细胞，树突状细胞等多种真核细胞的表面。在巨噬细胞中高水平表达，在T 淋巴细胞或293T 细胞系中不表达[2]。膜联单白可由单体和异源四聚体两种不同的形式存在[8]；单体主要在细胞质中，参与细胞内细胞器膜的组装、溶解和修复等一系列工作，异源四聚体主要分布在细胞膜的表面，由两分子的ANXA2 和A2t 组成，ANXA2 主要参与信号传导和钙离子通道的形成，调控炎症反应，细胞分化，囊泡运输，胞膜运动，细胞骨架间蛋白间的相互作用等多种生理生化过程。人ANXA2 与恶性肿瘤的存在有密切联系，对疾病发病机理研究有重要意义。有研究表明，ANXA2 作为J 亚群禽白血病病毒（ALV-J）的受体结合蛋白，显著抑制ALV-J 感染和复制[9]。ANXA2 作为一种新的抗病毒生物标志物，提示其可作为分子靶标，进行疾病早期诊断。研究结果为进一步对鸡ANXA2基因功能及深入研究其抗病毒机制奠定基础。