福建白兔胎儿成纤维细胞分离培养和鉴定

陈冬金 王锦祥 孙世坤 陈岩锋 桑雷 谢喜平

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所 350013)

福建白兔是福建省地方优良兔品种之一，2014 年列入国家畜禽遗传资源保护名录[1]。该品种全身被毛白色，体型较小，具有良好的繁殖性能、较强的抗病力、优质的肉品质等优点。当前对福建白兔种质资源保护、开发利用已成为福建白兔产业发展的共性需求。而相对于传统的畜禽保种场建设，体细胞保存具有成本低、占地少等明显优势。同时，建立福建白兔体细胞系对开展体细胞克隆、基因编辑、细胞水平功能等生物技术研究具有重要意义。

动物体细胞是生产克隆动物?转基因动物及基因编辑等分子生物学研究重要的细胞来源。动物胎儿成纤维细胞目前成为最常用的细胞之一，其与成年成纤维细胞相比具有以下优点：体外分离较容易、培养生长速度较快、纯度较高、易进行基因编辑等优点[2]、国内已有滩羊[3]、昆明犬[4]、广灵驴[5]、猪[6]、牛[7]等胎儿成纤维细胞系。以胎儿成纤维细胞为供体，已成功克隆出猪[8]、牛[9]和山羊[10]等此外，胎儿成纤维细胞为不同物质在细胞水平的功能研究提供了载体，如BALAJI S等[11]研究白介素-10 和透明质酸在小鼠胎儿成纤维细胞功能中的作用，WANG X 等[12]研究富含ras 同源基因与fk506 结合蛋白38 在山羊胎儿成纤维细胞中的直接相互作用。

家兔是毛用和肉用兼用型、节粮型的传统经济动物和草食动物。其饲草转化率较高，适宜农村养殖，是农村脱贫致富的首选畜牧产业之一，发展家兔产业对中国畜牧业转型升级具有重要作用。同时，兔由于其理化性能、调控机制和人类较相似，而且体型适中，是医学上常用的试验模式动物[13]。福建白兔与新西兰白兔相比，理化参数大部分相近，但其体型较小，成本低，有望开发成医学实验动物[14]。在兔的干细胞[15-17]、转基因兔[18，19]和克隆兔[20]方面的研究已取得较好的进展。本试验以20d 的福建白兔胎儿组织为研究对象，采用组织贴壁和酶消化法分离细胞、利用免疫荧光鉴定技术福建白兔胎儿成纤维细胞，以期为福建白兔种质资源保存、开发利用和相关分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）试验动物：怀孕20d 的福建白兔，购自福建省龙岩市武平县武东镇茶头岭福建白兔生态养殖场。

（2）试验试剂：培养基DMEM/F12、青霉素/链霉素溶液、PBS、胎牛血清FBS、武汉博士德抗体（纤维连接蛋白、角蛋白）等。

（3）试验仪器：洁净工作台SW-CJ-1D，CO2培养箱，移液器等。

1.2 试验方法

1.2.1 福建白兔胎儿成纤维细胞的分离与培养

使用酶消化法、细胞悬液培养法和组织块贴壁法对福建白兔胎儿成纤维细胞进行分离：采集胎兔，用75%的酒精消毒2～3 遍，然后用含双抗的PBS 洗涤3～4 次，去除头部、四肢、内脏及脂肪，将剩余的组织剪成约1mm3 大小的组织块，加入0.25%胰酶37℃消化5min，800rpm 离心3min 弃上清液。加入200IU/ml 的Ⅰ型胶原酶在37℃消化15min （期间每隔2min 轻轻吹打消化中的组织块），加入培养液（含有15%FBS 1%双抗的DMEM/F12 溶液）轻轻混匀后，300rpm 离心3min。细胞悬液培养：离心的上清液加入至培养瓶中，加培养液正常培养。组织块贴壁培养：离心的絮状沉淀组织块均匀接种于含有1ml 培养液的T25 细胞培养瓶中，每个培养瓶均匀放置9 个组织块，置于37℃，5%CO2，60%～80%相对湿度的培养箱中培养12h，待组织块贴于培养瓶后加入含有7ml 培养液再培养，每隔4～6h换一次培养液，用于去掉悬浮的脂肪等其他杂质组织，连续换液4～5 次后正常培养细胞。

1.2.2 福建白兔胎儿成纤维细胞传代和冻存

细胞生长汇合至85%～90%时，弃掉培养瓶中的培养液，用复温的PBS 洗涤两次，加入1ml 的0.25%胰酶，于37℃，5%CO2的培养箱中消化，大约3～5min 显微镜下观察细胞的形态变化，细胞变圆但未漂浮起来时，立即加入适量的培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，收集培养液，800rpm 离心3min 弃上清液。消化下来的细胞可以用于传代或冻存。传代：消化下来的细胞用适量10%胎牛血清1%双抗DMEM/F12 培养液制成细胞悬液，将悬液按一定比例(1：3) 接种于新的培养瓶中进行传代培养，通过2～3 次选择传代，可进一步纯化成纤维细胞，形成成纤维细胞系[21]。冻存：消化下来的细胞加入配置好的细胞冻存液（DMSO：完全培养液：血清=1：2：7）重悬细胞沉淀后取1ml 加入灭菌的冻存管中，封口膜严密封口，做好记号，并放于冻存盒中，放在4℃冰箱中1h，-80℃冰箱24h后，移出放于液氮中分类保存。

1.2.3 福建白兔胎儿成纤维细胞的复苏

将冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中轻轻晃动冻存管，使细胞悬液完全溶解，并吸入到预先加2ml 的含有20%FBS 1%双抗的DMEM/F12 溶液的离心管中，800rpm 离心3min 弃上清液，再用完全培养液重悬细胞沉淀，吸入到新的培养瓶中，加入8ml 完全培养液，于37℃5%CO2的培养箱中培养并检测复苏存活率。

1.2.4 细胞形态学观察

光学显微镜下观察兔胎儿成纤维细胞生长形态。

1.2.5 生长曲线测定

消化对数生长期的成纤维细胞，制成细胞悬液，计数后用培养液稀释，将细胞密度调整为1.0×104个/ml，接种于24 孔板中、接种日期记为0d，每隔24h 细胞计数一次，每次计3 孔取平均值，共计9d。以细胞生长时间为横轴，细胞数量为纵轴绘制生长曲线。

1.2.6 兔胎儿成纤维细胞的免疫荧光鉴定

武汉博士德的纤维连接蛋白fibronectin、武汉博士德的角蛋白cytokeratin、Invitrogen 的Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 的抗体，试验步骤如下。清洗：取出细胞爬片，吸弃培养液，细胞爬片用PBS 振荡洗3 次，每次5min；固定：用4%多聚甲醛覆盖细胞爬片，室温下固定15min，吸弃4%多聚甲醛，用PBS漂洗3 次，每次5min；透膜：用新鲜配制的含0.2% Triton-X-100 的PBS 在4℃通透化处理15min，用PBS 漂洗1 次，每次5min；封闭：用封闭液（即含5% BSA 的PBS）覆盖细胞爬片，37℃孵育1h；一抗孵育：用封闭液按1:50 稀释一抗，24 孔板中每个孔加入500μl 已稀释的一抗，4℃孵育过夜；回收一抗：用清洗液（即含0.02% Tween20 的PBS）漂洗细胞爬片3 次，每次5min；二抗孵育：用封闭液按1:100 稀释二抗，用铝箔纸包裹后在37℃孵育30min；去除二抗，用清洗液漂洗细胞3 次，每次5min；DAPI 复染：用PBS 按1:1000 稀释DAPI，室温避光孵育30min，去除DAPI 染液，加入PBS 缓冲液；封片：加入甘油，放入湿盒中4℃避光保存；观察：在荧光显微镜下观察玻片，用合适波段激发，拍照并保存试验结果。

2 结果

2.1 兔胎儿成纤维细胞的形态学观察

细胞悬液法分离的细胞：在悬浮细胞培养6h 后，观察到大部分细胞贴壁，形态呈现圆形，未展开。培养4d 后，细胞基本贴壁，形态不规则，呈多角形、梭形、扇形等，为典型的成纤维细胞形态。培养9～10d 后，细胞生长旺盛，密度达到85%～90%，开始消化或冻存细胞得以保种。

用组织贴壁分离的细胞：发现组织块贴壁2d 后就可在组织块周围看到明显的成纤维细胞，此时游离出来的细胞呈梭形、纺锤形或者不规则多角形，周围有少量上皮细胞，胞核清晰。培养第4 天，组织块周围有大量的成纤维细胞，成纤维细胞群开始向外分裂生长，此时细胞呈典型的多边形和长梭形；培养第8 天，组织块中基本不再游离出细胞，原游离的细胞呈现群体依赖性生长，呈典型的多边形和梭形，此时细胞可生长成单层，漩涡状排列或纵横交错，贴壁的细胞团呈放射状生长。第9 天由组织块移出的单层细胞铺满瓶底，可消化进行传代培养。细胞形态图，见图1。

2.2 细胞生长曲线

由图2 可知，福建白兔成纤维细胞的生长曲线呈典型的S型，分为典型的4 个生长阶段：潜伏生长期、对数生长期、平台期及衰亡期。0～2d 细胞生长比较慢，处在潜伏期；第3 天细胞数量开始增加，3～8d 细胞快速增长，进入对数生长期；8～9d细胞生长缓慢，处在平台期；第9 天后细胞数量减少，细胞进入衰亡期。从生长曲线上图2 可分析出，原代胎儿成纤维细胞群体倍增时间约为36h。

2.3 复苏存活率

成纤维细胞冻存前和冻存后的细胞活率大约为95%，冻存前后的细胞存活率差异不显著。

2.4 免疫荧光鉴定兔胎儿成纤维细胞

图1 福建白兔胎儿成纤维细胞生长形态(100x)

图2 福建白兔原代成纤维细胞生长曲线

细胞角蛋白染色为阴性，见图3-A1、A2、A3；纤维连接蛋白染色为阳性，见图3-B1、B2、B3；这结果说明分离出来的兔胎儿成纤维细胞纯度较高，活性较好。

3 讨论

3.1 福建白兔胎儿日龄的选择

福建白兔90 日龄成年体重（1514.44g）比中型新西兰白兔同期体重（2034.42g）小且差异显著[14]，其胎儿体重也比较小。研究表明，12～18d 的胎儿都可作为兔胎儿成纤维细胞的来源[22，23]，故本试验选择福建白兔20 日龄的胎儿作为试验材料。

3.2 成纤维细胞分离方法的选择

图3 福建白兔胎儿成纤维细胞免疫荧光检测(100x)

当前对胎儿成纤维细胞的分离主要是采用组织贴壁法和酶消化法，或者两者同时使用[3,24]。本试验细胞分离采用两种方法：首先是用胰酶消化，再用Ⅰ型胶原酶消化，然后一种是用消化好的细胞悬液直接培养分离成纤维细胞，另一种是用消化好的组织块贴壁进行分离培养细胞。两种方法分离出来的原代细胞进行对比：在形态上组织贴壁分离的细胞长得更整齐，生长速度上细胞悬液分离的细胞生长速度更快；但经过2 代培养后，这两种方法分离的细胞生长速度和形态就没有较大区别，这与刘西梅等对成纤维细胞的分离培养研究结果相近[25]。

3.3 免疫荧光检测对细胞进行鉴定

本试验除了从细胞形态学和生长曲线图对细胞进行鉴定，均符合成纤维细胞特性外，还采用免疫荧光法进行鉴定。纤维连接蛋白是成纤维细胞的标志之一，角蛋白是上皮细胞的标志之一[26]，采用了纤维连接蛋白和角蛋白对福建白兔胎儿成纤维细胞进行检测，结果显示纤维连接蛋白染色结果阳性，表明该细胞属于成纤维细胞；细胞角蛋白染色呈阴性，说明没有被上皮细胞污染。

4 结论

福建白兔是我国地方优良兔品种，本试验采用组织块贴壁法和酶消化法成功分离了福建白兔胎儿成纤维细胞，并利用免疫荧光进行鉴定，初步建立了福建白兔胎儿成纤维细胞系，为今后开展福建白兔种质资源的保存、体细胞克隆、转基因兔及基因敲除等试验奠定基础。