原发性肝癌的分子诊断标记物研究进展

王凯 高帅

原发性肝癌是目前我国第四位的常见恶性肿瘤及第三位的肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康[1]。在我国，肝癌的高危人群主要包括：感染乙型肝炎病毒和（或）丙型肝炎病毒、长期酗酒、非酒精性脂肪性肝炎、食用被黄曲霉毒素污染食物、各种原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史等的人群，尤其是年龄40岁以上的男性风险更大。外科手术治疗是肝癌的主要治疗方式之一。然而，大部分患者确诊时已达中晚期，能获得手术切除机会的患者仅有20%～30%[2]。对肝癌高危人群进行筛查，早期发现、早期诊断、早期治疗小肝癌，是提高肝癌疗效的关键。影像学检查和血清分子诊断标记物是当前肝癌早期筛查的主要手段。影像学检查主要包括B超、CT和磁共振等，通过直观的肝脏占位性肿瘤包块来判断肝癌[3]。分子诊断标记物的检测在原发性肝癌的筛查、早期诊断、预后判断、复发检测等发面发挥着重要作用。

近年来，随着分子生物学、细胞生物学和人类基因组学、蛋白质组学等基础学科向癌症研究领域的延伸，肝癌分子诊断标记物的研究取得了巨大的进展。本文将对近年来肝癌分子诊断标记物的研究做一综述，以期对后期的临床工作和科学研究提供指导。

1 肝癌相关基因

正常细胞的生长与增殖受两大类基因调控。原癌基因提供正向调控信号，其可促进肿瘤细胞生长和增殖，并且阻止其发生终末分化倾向。抑癌基因提供负向调控信号，促使细胞成熟、终末分化和细胞凋亡。正常情况下这两类信号保持着动态平衡，精准地调控细胞增殖和成熟。一旦这两类信号中有一类信号过强或过弱均会使细胞生长失控而导致恶变。研究显示，多种致癌基因参与了肝癌的发生、发展。这些基因改变与肿瘤抑制基因、癌基因、发育途径的激活、生长因子及其受体相关，导致肝癌在细胞水平上保持异常高的复制水平，并使细胞避免凋亡的过程。

其中，具有代表性的基因如PTEN基因、p53基因、IGF-2基因、TGF-α基因、c-myc基因、ras基因等，直接参与介导肝癌的发生、发展，并可作为肝癌早期诊断的特异性分子标记物[4]。Chen等人的研究中发现，大约50.3%的肝癌组织中可检测到PTEN基因的低表达，与CD133、Ep CAM和CK19的高表达呈正相关。PTEN基因低表达是肝癌复发和总体生存率的独立预测因素[5]。Liao等人通过加权基因共表达网络研究发现，P53基因相关信号通路是导致乙型肝炎相关肝癌发生、发展的核心通路之一[6]。另一项研究显示，c-myc可与HBx协同诱导非经典前折叠素RPB 5相互作用因子1（URI1）蛋白的表达升高，从而促进原发性肝癌的发生、发展[7]。Ha等人的研究中，IGF-2介导的E-cadherin蛋白缺失是导致小鼠肝肿大和肝癌细胞异常生长的关键因素。HBx诱导的IGF-2是可作为肝癌的潜在生物标记物，也是肝癌的治疗靶点之一[8]。

2 DNA甲基化标记物

表观遗传学是指非遗传改变（DNA甲基化、组蛋白修饰以及miRNA等非编码RNA等）对基因表达调控，这种调节不依赖基因序列的改变且可遗传，其中DNA甲基化是最常见的表观遗传现象。DNA甲基化是表观遗传学的重要调控机制之一，它是以S-腺昔蛋氨酸为甲基供体，在DNA甲基转移酶（DNMT）介导下，将甲基基团转移到DNA某些碱基上的过程。DNA甲基化多发生在CpG岛上，是一种转录水平的DNA修饰方式，它能调节基因表达，并且在维持细胞正常分化、疾病的发生和发展中起重要作用。基因启动子区域的DNA甲基化可抑制基因表达，在恶性疾病的早期诊断、风险评估、早期复发预测、治疗反应监测及预后判断中发挥重要作用，是目前的热点研究方向。异常的DNA甲基化位点已经成为恶性肿瘤最有前景的分子标记物之一[9]。

有研究发现，基因组中常见的重复序列如LINE-1和Alu在肝癌患者中存在明显的甲基化异常，或可作为肝癌诊断的标记物和治疗的靶点[10]。我们的研究也发现，原发性肝癌具有特异的基因甲基化特征。在一项研究中，我们分析了178例手术切除的肝癌组织和20例正常肝组织中TFPI2基因的甲基化状况。结果显示，TFPI2基因在肝癌组织中的甲基化率为44.9%，癌旁组织中的甲基化率为10.7%，正常肝组织中的甲基化率为5.0%。同时，TFPI2基因甲基化与肿瘤复发和预后差明显相关[11]。另一项研究中，我们分析了血清游离DNA中IGFBP7基因的启动子甲基化状态，结果显示，肝癌患者血清游离DNA中的IGFBP7基因存在明显的甲基化，IGFBP7基因甲基化与肝癌患者氧化损伤状况、术后总体生存率及早期复发率有关[12]。联合应用IGFBP7基因甲基化和AFP用于肝癌诊断时，其诊断效能明显高于单独应用AFP[13]。我们进一步分析了肝癌患者外周血单个核细胞中基因的甲基化状况，结果显示，肝癌患者外周血单个核细胞中NKG2D基因启动子区域程度明显高于慢性肝炎患者和正常对照者，NKG2D基因可作为肝癌诊断的良好生物标记物[14]。

3 miRNA

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性短链（17-25个核苷酸）非编码RNA，其可以与信使RNA（messengerRNA，mRNA）的3’非编码区结合诱导其降解。目前已有约500个miRNA基因被发现，其具有广泛的生物学功能，可以调控细胞重要的生理过程。miRNA既可以作为原癌基因，也可以作为抑癌基因行使功能[15]。在肝癌中，miRNA参与调节细胞增殖分化及凋亡、上皮间充质转化、转移、血管新生等肿瘤相关病理过程。因此，miRNA的水平与肝癌的发生和进展密切相关，可作为诊断肝癌的候选标记物。

已有研究发现一些miRNA具有较好的诊断效能。例如，有研究发现miR-122的水平在肝癌中显著上调，在健康人群中应用miR-122诊断肝癌的敏感性为90.0%，特异性为94.0%，AUC为0.954，而miR-122鉴别良恶性肝脏肿瘤的敏感性为64%，特异性为62%，AUC为0.667[16]。此外，miR-148a被认为是一种肝癌特异性miRNA，与肝硬化患者相比，肝癌患者血浆miR-148a的水平显著降低，应用血浆miR-148水平从肝硬化患者中诊断肝癌的敏感性为89.6%，特异性为89.0%，AUC为0.919，而在AFP水平较低的肝癌患者中，miR-148诊断肝癌的敏感性可达90.6%，特异性可达92.6%，AUC为0.949[17]。一项荟萃分析发现，miR-125b诊断HBV相关肝癌的敏感性达95%，特异性达0.79%，AUC为0.95[18]。对于此类诊断敏感性较高的miRNA，可用于筛查早期肝癌，特别是在AFP水平较低的患者中更具意义。与单个miRNA相比，多种miRNA的组合可显著提高其诊断效能。在一项纳入934例受试者的研究中，miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a及miR-801的组合对于HBV相关肝癌的诊断具有较高的诊断价值，其从CHB患者和肝硬化患者中诊断肝癌的AUC分别为0.842和0.884，而对于早期肝癌（BCLC0期和A期），该组合的诊断AUC达0.884[19]。

近年来，外泌体miRNA在肝癌中的功能日益受到关注。一些特定的miRNA可在外泌体中富集，参与细胞间的信号传递。而外泌体的磷脂膜结构可以使包裹的miRNA在血液中更加稳定，具有较高的无创诊断价值[20]。有研究发现，与CHB及肝硬化患者相比，肝癌患者血清外泌体miRNA水平发生显著变化，其中，miR-18a、miR-221、miR-222及miR-224水平显著上调，而miR-101、miR-106b、miR-122及miR-195水平显著下调[20]。另一项研究发现，与肝硬化相比在肝癌中，血清外泌体miR-122、miR-148a及miR-1246水平显著上调，其诊断AUC分别为0.816、0.891、0.785[21]。外泌体miRNA在肝癌早期诊断中的应用仍有待于进一步研究和验证。

4 LncRNA

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，约占RNA分子的68%[22]。lncRNA可与转录因子相互作用影响其与靶基因的结合，也可参与染色质重排发挥增强子作用或作为分子海绵与miRNA或蛋白结合，在转录、转录后及翻译等多个水平发挥其调控作用[23]。在肝癌中，与miRNA类似，lncRNA也可参与细胞增殖分化及凋亡、上皮间充质转化、侵袭和转移等多个肿瘤生物学过程[24]。

研究表明，多个lncRNA在肝癌表达异常或功能失调，如HOTAIR、MALAT-1、HOTTIP、H19、UCA1、HULC、GAS5、MEG3等[25]。其在肝癌中表达水平的差异为其作为候选诊断标记物提供了可能。例如，HEIH作为一种原癌lncRNA，不仅在肝癌肝组织中高表达，其在HCV相关肝癌患者血清中表达也异常升高[26]。Xu等研究了两种血清外泌体lncRNAENSG00000258332.1和LINC00635用于肝癌诊断的准确性。研究发现，与CHB患者及肝硬化患者相比，这两种血清外泌体lncRNA在肝癌患者血清中均呈高表达。其中，ENSG00000258332.1从CHB患者中诊断肝癌的敏感性为71.6%，特异性为83.4%，AUC为0.719；而LINC00635用于诊断的敏感性为76.2%，特异性为77.7%，AUC为0.750，均优于AFP（敏感性为54.7%，特异性为75.3%，AUC为0.666），而三者联合用于诊断AUC可达0.894（敏感性为83.6%，特异性为87.7%）[27]。这些发现表明利用lncRNA作为无创诊断标记物具有广阔的应用前景。lncRNA应用于肝癌早期诊断有待更多大样本临床研究进行验证。

5 蛋白标记物

AFP仍然是目前应用最广泛的肝癌诊断标记物，以20ng/mL为诊断阈值用于早期肝癌诊断，只有大约1/3患者可以得到诊断。其低敏感性限制了其作为早期肝癌筛查标记物的应用价值。而以较低诊断阈值用于早期肝癌诊断，AFP可能获得更好的敏感性，因此确定AFP的最优诊断阈值仍有待于更多研究证据。为提高AFP的诊断准确性，AFP可与其他诊断指标联合应用。除AFP以外，其他用于肝癌诊断的蛋白标记物也得到了广泛研究。

AFP具有3种糖化类型，与扁豆凝集素的结合能力不同，分别为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。其中，AFP-L3仅来源于肿瘤细胞，因此被认为对于肝癌具有更好的特异性。AFP-L3的水平与AFP水平高度相关，但由于其更高的特异性，可用于AFP的替代检测。在一项纵向研究中，研究者发现AFP-L3对于早期肝癌的诊断效能并不优于AFP（AUC0.77vs0.73），而AFP和AFP-L3联合检测可获得更好的诊断效能（AUC0.83），以AFP 5ng/mL及AFP-L34%为诊断截点，二者联合检测的敏感性和特异性可分别达到79%和97%[28]。

维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导蛋白（protein induced by vitamin K absence orantagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）是因维生素K缺乏诱导产生的一种异常凝血酶原。在肝细胞恶性转化过程中，维生素K依赖羧化酶系统功能受损，诱导了PIVKA-Ⅱ的产生[29]。在肝癌发生过程中，其水平显著升高，因此可作为早期肝癌的筛查标记物。在一项来自国内的队列研究中，Wu等发现PIVKA-Ⅱ诊断肝癌的效能优于AFP（敏感性76.92%vs64.34%，特异性86.26%vs 73.28%），血清PIVKA-Ⅱ的水平与肿瘤大小、分化程度及BCLC分期等均显著相关，而对于早期肝癌的诊断，联合PIVKA-Ⅱ（AUC0.812）和AFP（AUC0.797）可得到更高的诊断效能（AUC0.849）[30]。

高尔基蛋白73（Golgi protein-73，GP73）是一种2型高尔基体特异性膜蛋白，广泛表达于各种组织上皮细胞中，而肝细胞中表达量较少。然而在肝癌患者中，血清GP73水平显著升高[31]。Jing等的研究发现GP73诊断肝癌的敏感性和特异性分别为92.31%和83.87%，阳性预测值为87.8%，阴性预测值为89.7%，具有较高的诊断价值[32]。

鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，广泛表达于鳞状上皮中。其在上皮来源的肿瘤中呈高表达，可使肿瘤细胞逃避凋亡[33]。由于SCCA的表达是肿瘤细胞去分化的结果，因此被认为是肝癌的潜在标记物。Yu等的一项荟萃分析发现，SCCA诊断肝癌的敏感性为0.61，特异性为0.80，AUC为0.76[34]。此外，在肿瘤发生的早期，由于SCCA的表达升高，其可与IgM结合形成免疫复合物（SCCA-IgM）。Liu等的一项荟萃分析发现，对于肝癌的诊断，SCCA-IgM的准确性与SCCA相当（0.77vs0.80），但其与AFP联合应用可获得更高的诊断准确性（AUC0.90）[35]。

6 小结与展望

肝癌起病隐匿，大多数患者在确诊时已错过手术或治疗最佳时机[36]。因此，肝癌的筛查和早期诊断对于治疗和预后具有十分重要的意义。由于肝癌高度的异质性，传统的诊断手段具有一定的局限性。随着分子生物学的不断发展，我们得以从分子层面窥见肝癌更微观的生物学特征。高通量测序、RT-PCR、芯片技术等分子诊断技术的发展使我们能够检测遗传及表观遗传学上DNA、RNA及蛋白水平的改变，并开发新的无创诊断标记物。本文中，我们主要从肝癌相关基因、DNA甲基化标记物、miRNA、lncRNA、以及蛋白标记物等方面展现了当前肝癌分子诊断标记物的研究进展。上述研究中我们可以看出，不同类型诊断标记物分别具有不同的临床应用特点，可分别用于肝癌的早期诊断、治疗方案选择、预后判断、复发预测等方面。同时，不同类型肝癌诊断标记物之间的联合应用，可增加它们的诊断效能。然而，尽管与传统诊断标记物相比，许多新型分子诊断标记物展现出更好的诊断效能，具有较好的转化价值和应用前景，但仍需要大量高质量的临床研究进行验证，为更好的临床应用提供坚实的证据和更优的联合策略。因而，发掘更多的特异性分子诊断标记物并加以验证，充分利用这些标记物的优势，取长补短，为肝癌的临床诊断、疗效监测、预后判断等服务，仍是当前一段时间临床研究的重要方向。