基于声辐射力脉冲弹性成像技术初步探索肝纤维化小鼠肝剪切波速

陈高峰，高志玲，楼唯薇，黄凌鹰#，金树根

(上海中医药大学附属曙光医院1. 肝病研究所，2. 超声诊断科，3. 肝病科，4. 细胞免疫室，上海 201203)

弹性成像除超声和磁共振二大类外，还有光和机械压力传感器等。在超声四大弹性成像技术即瞬间弹性成像（transient elastography，TE）、声辐射力脉冲弹性成像（acoustic radiation force impulse imaging，ARFI）、实时组织弹性成像（real-time tissue elastography，RTE）和实时剪切波弹性成像（real-time shear wave elastography，SWE）中，应用于肝纤维化检测的Fibroscan和FibroTouch是采用TE技术开发的，其中FibroTouch是TE与二维超声影像技术结合。虽然Fibroscan和FibroTouch广泛应用于临床肝病患者的肝纤维化检测和疗效评价观察，但临床实践发现炎性反应因素影响检测结果[1]。迄今为止，Fibroscan和FibroTouch仍不能在大鼠和小鼠的肝纤维化实验中应用。仅有一项研究采用TE技术研发出一种瞬间微弹性成像技术，成功应用于检测小鼠四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化和淀粉样变性模型[2]。与Fibroscan和FibroTouch仅限于检测肝纤维化不同，理论上ARFI可检测其他组织器官弹性变化。目前，ARFI的声触诊组织量化已被应用于大鼠肠[3]、肝[4-5]、眼[6]和脑[7]组织炎性损伤、脂肪变性和纤维化检测的动物实验， 但未见应用于小鼠肝纤维化检测的报道。本研究采用ARFI技术检测CCl4诱导小鼠肝纤维化时肝内剪切波速变化，评估其作为一种可替代肝活检的实时、非创伤性诊断肝纤维化方法的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠 40 只，6周龄，体质量（24±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK（沪）2017-0005]。小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心[S Y X K（沪）2014-0008]，饲养室温度25～26 ℃，相对湿度 50%～60%，光照周期明暗各12 h，自由饮食。适应性饲养一周后开始实验。

1.2 试剂

CCl4购自国药集团化学试剂有限公司，采用市售食用油（福临门一级大豆油，中粮集团生产）配成质量分数为1%；异氟烷（isoflurane）购自河北一品制药股份有限公司。

1.3 主要仪器设备

呼吸麻醉机（中国瑞沃德，R500）、彩超仪（德国西门子，SC2000）、小动物光声成像系统（加拿大Fuji，LazrX)、脱水机（德国莱卡，ASP 300S）、包埋机（德国莱卡，EG1150H）、切片机（德国莱卡，RM2235）、显微镜（日本奥林巴斯，D P 7 1）及其图像处理分析系统（MediaCybernetics, Image-Pro Plus）。

1.4 CCl4染毒制备肝纤维化模型及分组

10只雄性小鼠作为对照组，自实验开始采用食用油（0.1 mL/20 g 体质量）隔日一次灌胃，共8周。4周组（1 5只）在实验1～4周，采用上述食用油隔日一次灌胃，实验第5周开始灌胃CCl4食用油混合液（250 µL/kg）染毒，隔日一次，共4周。8周组（15只）在实验第1周开始灌胃CCl4食用油混合液（250 µL/kg）染毒，隔日一次，共8周。实验8周后各组均正常饲养2周。实验结束，处死小鼠并收集肝组织样本，之前12 h禁食不禁水。

1.5 多模式小动物光声成像系统B超检测肝灰度

用4%的异氟烷诱导麻醉小鼠后，用1.5% 的异氟烷维持麻醉小鼠。采用多模式小动物光声成像系统，高频线阵探头，频率40 MHz，观察小鼠肝右叶同一区域，读取肝灰度值。

1.6 ARFI法检测肝内剪切波速

如前麻醉状态下，采用西门子Acuson S2000彩色多普勒超声诊断仪，9L4高频线阵探头，频率9 MHz，观察各小鼠肝右叶同一区域，等待图像保持平稳后，切换UPDATE按钮，自动计算出结节内感光区域剪切波的速度。

1.7 肝组织HE与天狼猩红胶原染色

肝组织经中性甲醛缓冲液固定，石蜡包埋。HE染色：石蜡切片，切片厚度为4 µm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇溶液水化，蒸馏水洗3～5 min，Harris苏木精染色15 min，自来水洗3～5 min，5%盐酸乙醇溶液分化10 s，水洗蓝化 3～5 min，镜检细胞核，伊红复染10 s，梯度脱水，二甲苯透明，封固。天狼猩红胶原染色：石蜡切片，切片为4µm厚度，二甲苯脱蜡，梯度乙醇溶液水化，蒸馏水洗3～5 min，天狼猩红染色液滴染15 min，无水乙醇分化，二甲苯透明，封固。胶原染色阳性面积分析：采用Olympus DP71显微数码CCD采集图片，用Image-Pro Plus 6.1进行肝组织胶原面积（反映纤维化）半定量分析。

1.8 数据处理

所有数据均采用SPSS 15.0软件进行统计学分析，组间差异比较采用方差分析法，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCl4染毒4周和8周时B超检测小鼠肝灰度和肝内剪切波速变化

正常小鼠的肝超声灰度为0.6，染毒4周、8周时肝超声灰度均为1.6左右（图1）；正常小鼠肝内剪切波速为0.6～0.8，染毒4周、8周时小鼠肝内剪切波速均在2.6～2.8。

2.2 CCl4染毒4周和8周后正常饲养2周时肝内剪切波速变化

与对照组比，CCl4染毒4周和8周后正常饲养2周时肝内剪切波速依次增加（均P＜0.05），各组肝内剪切波速变化见图2和表1。

2.3 CCl4染毒4周和8周后正常饲养2周时小鼠肝组织病理改变

CCl4染毒4和8周后正常饲养2周时肝纤维化半定量分析结果见表2。

与正常组（图3 A、D）比，4周组（图3B、E）肝细胞的细胞质疏松，汇管区没有明显炎性细胞聚集，汇管区胶原纤维变粗向肝实质伸入；8周组（图C、F）肝细胞的细胞质疏松明显，汇管区炎性细胞聚集，胶原纤维变粗且向肝实质伸入，形成典型的P-P、P-C纤维间隔（假小叶形成）。

图 1 CCl4染毒4周和8周时小动物光声成像系统LazrX检测小鼠肝超声灰度值Figure 1 The gray scale value of liver ultrasound in mice at 4 and 8 weeks after CCl 4 exposure was detected by photoacoustic imaging system LazrX

图 2 CCl4染毒4周和8周后正常饲养2周小鼠肝内剪切波速Figure 2 The intrahepatic shear wave velocity at 2 weeks of normal feeding after CCl 4 exposure for 4 and 8 weeks

表 1 CCl4染毒4周和8周后正常饲养2周时肝内剪切波速Table 1 The intrahepatic shear wave velocity (SWV) at 2 weeks of normal feeding after CCl4 exposure for 4 and 8 weeks

表 2 CCl4染毒4周和8周后正常饲养2周时小鼠肝纤维化Table 2 The liver fibrosis semi-quantitative analysis of mice at 2 weeks of normal feeding after CCl4 exposure for 4 and 8 weeks

图 3 CCl4染毒4周和8周后正常饲养2周时小鼠肝组织病理改变Figure 3 The pathological change of mouse liver tissues at 2 weeks of normal feeding after CCl 4 exposure for 4 and 8 weeks

3 讨论

采用小动物光声成像系统LazrX对肝纤维化造模小鼠检测发现，CCl4染毒4周、8周肝纤维化模型小鼠肝实质灰度相近，同时采用ARFI技术检测CCl4染毒所致的肝纤维化小鼠肝剪切波速，发现结果与小动物光声成像系统LazrX肝内灰度检测结果完全一致。考虑低剂量CCl4染毒肝损伤多在24 h前后达最高峰，肝内炎性坏死2周后消失，几乎接近正常[8]。在CCl4染毒4周、8周后正常饲养2周再进行肝剪切波速检测，发现肝内剪切波速在CCl4染毒8周后正常饲养2周组＞CCl4染毒4周后正常饲养2周组>正常对照组，与肝内纤维化改变相一致。上述结果与临床检测发现肝功能异常可致肝弹性检测硬度明显上调，随肝功能恢复正常而肝弹性检测硬度下调[9-12]完全一致。除了实时与非创伤性，考虑ARFI还能检测肝以外其他器官组织[3,6-7]。因此，只要排除炎性损伤改变，ARFI可作为替代活检的诊断纤维化的有效方法。换言之，因为急性炎性损伤也能导致超声成像的剪切波速改变[13-16]，所以可利用此特点将ARFI技术应用于急性肝等组织器官损伤的临床诊治和抗肝等组织器官损伤的药物筛选中。目前，已开展对CCl4中毒大鼠急性肝损伤进行ARFI法动态检测肝内剪切波速变化的研究，旨在建立一个实时、非创伤性抗急性肝损伤的药物筛选平台。

另外，考虑SC2000检测剪切波速时取框大而且固定不可调小，因此实验动物应尽量选择体质量大一些的成年小鼠。本课题组同时对大鼠肝剪切波速检测发现，3～4周龄正常大鼠肝脏因体积小而受管道干扰，其检测到的肝剪切波速竟高于6月龄大鼠。大龄大鼠因肝脏体积大，如选择检测部位不同其所含管道密度也不同，肝剪切波速相差很大，这一现象也似表明：与其说反映肝剪切波速增龄性变化不太明显， 不如说其含管道密度影响肝剪切波速检测结果（将另文发表）。小动物B超如富士 VisualSonics 公司VEVO系列2100、3100，特别是最新升级版的多模式光声成像系统LazrX，因其高分辨率（30～40 MHz甚至70 MHz），适合包括斑马鱼、小鼠在内的更小动物的急性肝炎和肝纤维化等慢性肝损伤的检测[17]。事实上，同时应用多模式光声成像系统LazrX的光声仪检测含氧与非含氧血红蛋白以分析肝内血氧饱和度时发现，急性肝损伤时肝内灌流不足导致严重缺氧，保肝有效药物可明显恢复肝内血氧供应，而CCl4等肝损伤药物明显加重了肝内缺血缺氧（结果待发表）。

综上所述，本研究结果表明，采用ARFI法进行肝剪切波速检测能反映小鼠肝纤维化变化，但炎性细胞浸润也导致肝剪切波速变化，因此须排除肝内炎性细胞浸润所致肝损伤对肝内剪切波速的影响。