人牙龈成纤维细胞在聚醚醚酮片和纯钛片表面的体外生物相容性比较*

于世德，黎日照，伍思俊，张 鹏，吕炳辉，乔建勋，颜 丹，罗湧彬

佛山科学技术学院附属口腔医院·佛山市口腔医院，佛山 528000

聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）是一种由羰基和醚基连接芳香环组成新型的半结晶性的全芳香族高分子聚合物［1］。由于其耐高温、耐腐蚀、耐磨、耐疲劳、阻燃以及绝缘等优异性能，同时还具有耐摩擦性、耐药品性、耐水分解性以及优良的生物相容性，PEEK 材料获得了广泛的应用［2-4］。在口腔医学领域，作为性能优异的骨替代材料，聚醚醚酮首先被应用在了颅面部骨缺损的修复上［5］。聚醚醚酮具有良好的生物相容性已经与骨具有相近的弹性模量，近年来在口腔领域引起了广泛关注［5-6］。在口腔种植领域，相比传统金属材质的口腔种植愈合基台，由聚醚醚酮材料制作的愈合基台具有较好的生物相容性以及更大的可调改空间，更有利于种植体后期的美学修复。

相比于传统的金属及合金生物材料，PEEK 在骨科领域具有更加巨大的临床应用前景［6］。 然而，关于PEEK 材料对于软组织修复应用的相关报道较少。因此，对于PEEK 材料在软组织修复方面的研究能够为日后其临床广泛应用，提供实验依据。本研究拟采用牙龈成纤维细胞与PEEK 以及Ti 片共培养后，比较两种材料对于牙龈成纤维细胞的黏附、增殖能力进行探究，为日后PEEK 材料应用于种植体基台材料对于软组织修复能力提供实验基础和理论依据。拓展了聚醚醚酮材料在口腔种植领域的应用范围，还为种植修复技术提供了新的方向和选择，对于口腔种植学和口腔材料学提供重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

聚醚醚酮（广东粤诚牙科技术开发有限公司），钛（广东粤诚牙科技术开发有限公司），扫描电子显微镜S-3000N（Hitachi，日本），CCK-8(东仁，日本)，全自动酶标仪Infinite200（Tecan 公司，瑞士），细胞死活染色试剂盒（碧云天，中国），罗丹明鬼笔环肽（索莱宝，中国）。

1.2 细胞培养

牙龈成纤维细胞取自南方医科大学南方医院口腔颌面外科门诊18～25 周岁阻生牙拔除患者正常牙龈组织。使用组织块培养法原代培养牙龈成纤维细胞，10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培养基培养，待细胞长至覆盖瓶底的80%时，细胞接种于各个试件表面接种密度为1 × 105个/mL。

1.3 试件制备

将直径为10.0 mm的PEEK和Ti制备成厚度为1.0 mm、直径为10 mm 的圆片状PEEK 试件和Ti 试件，用400#、500#、600#、1000#、2000#的碳化硅砂纸逐级打磨抛光。依次用丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗10 min，60 ℃水浴酸蚀30 min，乙醇浸泡紫外照射消毒灭菌后干燥备用，见图1。

图1 PEEK试件和Ti试件实物图

1.4 扫描电镜观察细胞的黏附形态

PEEK 组和Ti 组各组内随机选取试件，每个时间点每组设置3 个重复试件。将牙龈成纤维细胞按照相同密度（1 × 105 个/mL）， 接种于各试件表面， 分别于24 h 终止培养， 扫描电镜观察试件表面细胞形态。

1.5 死活细胞染色法检测细胞死亡

将打磨灭菌后的试件分别置于24孔板中，将处于对数生长期的牙龈成纤维细胞以1×105 个/mL 的密度接种于试件表面牙龈成纤维细胞，细胞培养箱中分别孵育6 h，12 h，24 h 后，吸除培养基，PBS 缓冲液清洗3 次，每孔加入250 μL细胞死活染色工作液，细胞培养箱避光孵育30 min，正置荧光显微镜下进行观察。

1.6 CCK-8方法检测细胞的增殖能力

PEEK 组和Ti 组各组内随机选取试件，每个时间点每组设置3 个平行试件，且每个时间点设置空白孔和背景孔。将牙龈成纤维细胞按照1 × 105个/mL密度接种于各试件表面，分别于6 h、12 h、24 h 终止培养，吸除培养基，按每孔500 μL体积配置实验所需CCK-8工作液，将各试件置于CCK-8 溶液中，避光孵育1 h～4 h，吸取100 μL混合液至96 孔板中，全自动酶标仪检测450 nm 波长下检测样本的吸光度值。

1.7 罗丹明鬼笔环肽染色检测细胞形态

取对数生长期的牙龈成纤维细胞按照1 × 105个/mL密度接种于各试件表面，培养6 h、12 h、24 h后，用4%多聚甲醛室温固定15 min； PBS洗涤3次，每次5 min，5 μg/mL的罗丹明鬼笔环肽室温避光染色40 min，PBS 漂洗3 次，DAPI复染。激光共聚焦荧光显微镜观察细胞形态变化。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism8 软件对结果进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示。对于两组独立样本数据，数据满足正态分布和方差齐性采用两独立样本的t 检验进行统计推断；数据满足正态分布，但方差不齐，采用校正的t检验。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 扫描电镜观察试件表面形貌

扫描电镜观察Ti 试件及PEEK 表面形貌，结果显示试件经过打磨酸蚀后表面呈不规则形，试件表面不平整。PEEK 试件表面呈不规则片层状结构，Ti 试件表面呈蜂窝状孔隙结构，见图2。

图2 扫描电镜观察PEEK及Ti表面形貌

2.2 扫描电镜观察细胞黏附形态

扫描电镜观察牙龈成纤维细胞在Ti 试件及PEEK 表面黏附情况。分别将牙龈成纤维细胞接种于灭菌后的Ti试件及PEEK 试件表面24 h 后观察细胞形态及黏附水平，结果显示牙龈成纤维细胞在细胞在PEEK 试件表面的黏附数量要多于Ti 试件表面。观察牙龈成纤维细胞黏附形态，结果显示牙龈成纤维细胞在PEEK 试件表面及Ti 试件表面成长梭形，形态不规则，呈典型的成纤维细胞形态。细胞在PEEK 试件表面较Ti 试件表面伸出较多丝状伪足及蛋白纤维丝，且在PEEK 试件表面铺展更开。结果显示牙龈成纤维细胞在PEEK 试件和Ti试件表面均可黏附与增殖，且在PEEK表面细胞黏附要优于Ti表面，见图3。

图3 牙龈成纤维细胞在PEEK及Ti试件表面黏附情况

2.3 细胞死活染色

将打磨灭菌后的试件分别置于24孔板中，将处于对数生长期的牙龈成纤维细胞以1×105个/mL 的密度接种于试件表面，分别培养6 h，12 h，24 h 后进行Calcein-AM/PI免疫荧光染色。荧光正置显微镜观察，结果显示Ti试件表面较PEEK 试件表面在6 h，12 h，24 h均出现了较多PI染色的死细胞，而PEEK 试件表面未见明显PI 染色的死细胞，且活细胞多于Ti试件组，见图4。

图4 龈成纤维细胞在PEEK及Ti试件表面培养不同时间细胞死活染色

2.4 CCK-8法检测细胞增殖能力

将PEEK 试件，Ti 试件分别与牙龈成纤维细胞共培养6 h，12 h，24 h，CCK-8法检测细胞增殖水平。结果显示PEEK 试件，Ti 试件与牙龈成纤维细胞共培养6 h、12 h、24 h 后，PEEK 试件表面细胞增殖能力均优于Ti 试件组；随着共培养时间增长，细胞增殖增加。即牙龈成纤维细胞在PEEK 试件表面培养6 h、12 h、24 h的活细胞数均高于Ti试件组，见图5。

2.5 细胞黏附检测

将打磨灭菌后的试件分别置于24孔板中，将处于对数生长期的牙龈成纤维细胞以1×105 个/mL 的密度接种于试件表面，分别培养6 h、12 h、24 h后进行罗丹明鬼笔环肽荧光染色，检测细胞的形态以及黏附于材料表面情况。结果显示细胞接种6 h、12 h、24 h，牙龈成纤维细胞均可黏附于试件表面，而在PEEK 试件表面细胞黏附效果更佳，细胞铺展更开，伸出更多伪足。实验结果表明PEEK 较Ti更有利于黏附细胞的伸展，见图6。

图5 材料与牙龈成纤维细胞共培养不同时间细胞增殖性能测定，*表示P＜0.05

图6 牙龈成纤维细胞在PEEK及Ti试件表面培养不同时间细胞黏附形态检测

3 讨论

随着口腔技术的不断发展, 各种材料被应用于种植体穿龈部分的研发。PEEK 是一种具有良好生物性能的高分子材料，在骨修复中具有广泛的应用，研究表明PEEK 的机械性能优于现有的牙科金属材料，并且与骨具有相近的弹性模量［7］。在口腔医学领域，作为性能优异的骨替代材料，聚醚醚酮首先被应用在了颅面部骨缺损的修复上。近年来在口腔种植领域也有广泛的应用［6,8］。牙种植体材料是否具有良好的细胞黏附增殖性能，是评价其生物学性能的重要指标之一［9-10］。种植体植入种植窝内，种植窝周围血液中蛋白能够迅速吸附在种植体表面，诱导细胞黏附于种植体表面，为之后的愈合发挥重要作用［11］。越来越多的研究关注种植体表面软组织的修复。但是其对于软组织的修复能力的相关研究未见报道。本实验对PEEK 及传统种植基台材料Ti 进行了体外细胞生物相容性的比较，通过牙龈成纤维细胞在PEEK 及Ti材料表面的黏附、增殖能力评价PEEK 的细胞生物相容性，探讨PEEK 作为牙种植基台新材料的可能性。

本实验制备PEEK 和Ti 标准化试件，经过粗糙度不同的碳化硅砂纸打磨后，经过酸蚀，清洗，杀菌后，使用扫描电子显微镜观察试件表面形貌。通过分别将牙龈成纤维细胞接种于PEEK 及Ti 试件表面共培养6 h、12 h、24h 后利用扫描电子显微镜，CCK-8及免疫荧光检测细胞的增殖及黏附性能。实验结果显示，经过打磨酸蚀杀菌后的PEEK 表面呈片层状，不规则粗糙的形貌，而Ti 试件表面表面呈蜂窝状多孔粗糙形貌。将牙龈成纤维细胞接种于试件表面24 h 后，扫描电镜观察显示，牙龈成纤维细胞在PEEK 表面和Ti 表面均可黏附生长，但在PEEK 试件表面较Ti试件表面细胞铺展更开，伸出更多的纤毛和伪足。说明牙龈成纤维细胞在PEEK 表面黏附性更好。CCK-8 检测，实验结果显示，将牙龈成纤维细胞接种于试件表面培养6 h、12 h、24 h 后，细胞在PEEK 表面细胞增殖能力更强，在6 h、12 h、24 h 细胞增殖能力均强于Ti 试件组。活细胞死细胞染色结果显示，细胞接种于PEEK 表面6 h、12 h、24 h 后，试件表面均没有出现明显的PI染色的死细胞，而在Ti表面出现了少量PI染色的死细胞，且随着培养时间的增长，死细胞染色增多。罗丹明鬼笔环肽染色结果同样显示，牙龈成纤维细胞在PEEK 试件表面较Ti 试件表面铺展更开，细胞形态更长，伸出伪足更多。实验结果与扫描电镜结果一致。

理想的种植体材料应该具有良好的生物相容性，能够促进促进细胞的增殖和黏附。PEEK 作为一种具有优良理化特性的生物医学高分子材料，在临床上具有良好的应用前景［12］。本实验通过比较PEEK 及Ti对于牙龈成纤维细胞的增殖黏附能力，验证PEEK 的体外生物相容性。实验结果显示PEEK和Ti相比具有更好的生物相容性，能够在体外促进牙龈成纤维的黏附增殖。但是有实验表明PEEK由于过于稳定的化学结构，使得其具有明显的惰性及疏水性［4］，严重限制了其生物学应用。因此更多关于PEEK 及其改性的相关研究仍需进行，为下一步的临床应用提供依据和参考。