胚胎12.5天暴露于丙戊酸钠大鼠发育及行为性别差异的研究*

赵 刚

1.深圳市南山区妇幼保健院儿童康复科，广东 深圳 518067；

2.哈尔滨医科大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学教研室，哈尔滨 150081

孤独症是一种神经发育障碍性疾病，主要症状是社交障碍，行为重复刻板、兴趣狭隘［1］，同时伴随多种神经行为紊乱，如学习障碍，多动和焦虑［2,3］。2014 年美国CDC数据显示，孤独症谱系障碍发病率为14.7‰［4］。作为一种复杂性疾病，孤独症的病因涉及遗传、表观遗传和环境等因素［5］。

孤独症男女发病比例达4.2∶1［6］。此外，临床症状上也存在性别差异。对孤独症的研究显示，女孩社交和沟通能力明显低于男孩［7-9］，而男孩比女孩存在更多重复刻板行为和异常兴趣。一直以来，胚胎期致畸药物的使用被认为是孤独症发病的重要原因。如果孕妇服用丙戊酸钠（VPA），后代患孤独症的风险将增加。而胚胎早期暴露于VPA大鼠，也表现出类似孤独症样改变［10］。

目前VPA 大鼠模型仍然存在局限，包括对VPA 大鼠发育和行为性别差异的研究。如果能使用性别二态性分析阐述VPA大鼠发育和行为特征，将有利于这一动物模型的完善，促进对孤独症病因认识。

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar 大鼠，体重200～250 g。Morris 水迷宫视频跟踪分析系统（成都太盟科技有限公司），YH-OF 自动跟踪系统（武汉一鸿科技有限公司），VPA粉剂（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立：大鼠雌雄2∶1 合笼过夜，次日清晨检测到阴栓的雌鼠认为交配成功，记为胚胎第一天（E1）。参照Schneider 等［10］方法，E12.5 受孕雌鼠随机分两组，模型组按600 mg/kg 剂量单次腹腔注射250 mg/ml VPA 溶液，盐水组注射等体积生理盐水。模型组和盐水组雌鼠所生仔鼠分别记为VPA组和对照组。仔鼠出生后第21天（PND21）断奶，雌雄分笼饲养，形成对照组（雄性、雌性）、VPA 组（雄性、雌性）。每组取6 只大鼠进行后续研究。

1.2.2 发育指标检测：PND7、14、21、28、35，测量体重；（2）PND12-16，评定睁眼情况。评分标准：2 分—睁开2只眼睛；1分—睁开1只眼睛；0分—未睁开眼睛；（3）PND7-10，测试前庭发育。使用光滑倾斜板（25°），将大鼠头向下放置，记录头部转动180°所需时间；（4）PND10、12、14、16，测试游泳能力。恒温水槽28℃，测试时间5 s。评分标准：4 分—鼻子与水面平齐或以上，双耳在水面以上；3 分—鼻子与水面平齐或以上，双耳与水面平齐；2 分—鼻子与水面平齐或以上，双耳在水面以下；1分—鼻子在水面以下，头顶在水面以上；0分—头顶在水面以下。

1.2.3 行为指标检测：（1）水迷宫测试：PND21-28，评估大鼠学习记忆能力。定位划行实验：隐蔽平台放在第三象限中心水下1 cm。1～3 天，训练大鼠60 s 内寻找隐蔽平台。如未找到，将其引至平台，停留10 s。4～7 天，记录大鼠爬上平台潜伏期。空间探索实验：即第8 天，除去平台，记录大鼠60 s 内穿越平台位置次数。（2）旷场实验：PND29-35，评估大鼠自发活动。根据Kim［11］方法，使用配备摄像头的自动跟踪系统记录30 min内大鼠移动距离和移动持续时间。（3）三箱社交实验：PND28-35，评估大鼠社交行为。方法改编自Crawley［12］，测试工具为三箱。使用配备摄像头的自动跟踪系统记录被试大鼠在三箱内停留时间及运动轨迹。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 13.0 统计分析。组间比较采用方差分析，组别（VPA 组/对照组）和性别（雌性/雄性）作为组间因素，如果发现任何一个因素存在显著效应，则采用LSD 检测进行Post Hoc 多重比较。水迷宫定位划行实验采用重复测量方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义，数据用均值±标准误表示。

2 结果

2.1 发育指标检测

PND14，VPA 大鼠体重显著低于对照组（P＜0.05）；PND14、21、35，雌性总体体重显著低于雄性（P＜0.05）；PND14，存在性别与组别交互作用（P＜0.05）。Post hoc 比较发现，PND14，VPA 雄性大鼠体重显著低于对照组雄性大鼠（图1a）。PND13-15，VPA 大鼠睁眼情况评分显著低于对照组（P＜0.05），无性别差异及交互作用（图1b）。PND7-10，VPA 大鼠趋地性测试评分显著高于对照组（P＜0.05），无性别差异及交互作用（图1c）。PND10、12、14、16，VPA 大鼠游泳能力显著低于对照组（P＜0.05），无性别差异及交互作用（图1d）。

2.2 行为学检测

2.2.1 水迷宫测试：定位划行实验（图2a），4 天测试中，VPA 大鼠逃避潜伏期均显著长于对照组（P＜0.05），随着训练次数增加，两组逃避潜伏期均显著缩短，但VPA组缩短程度显著低于对照组。两组大鼠逃避潜伏期均没有显示出性别差异（P＞0.05）。空间探索实验（图2b），VPA 大鼠穿越第三象限中心次数显著低于对照组（P＜0.05），但无性别差异及交互作用。

2.2.2 旷场实验：自发活动距离（图2c），VPA 大鼠自发活动距离显著长于对照组（P＜0.05）；雄性显著短于雌性（P＜0.05）；性别与组别存在交互作用（P＜0.05）。Post hoc比较发现，VPA雄性大鼠自发活动距离显著高于VPA雌性大鼠，表现出性别差异。自发活动持续时间（图2d），VPA大鼠自发活动持续时间显著长于对照组（P＜0.05）；雄性显著短于雌性（P＜0.05）；性别与组别存在交互作用（P＜0.05）。Post hoc 比较发现，VPA 雄性大鼠自发活动持续时间显著长于VPA雌性大鼠。

图-1.VPA诱导孤独症模型大鼠生长发育测量结果

2.2.3 三箱社交实验：探索陌生大鼠1 和空笼子的时间（图2e），VPA 大鼠探索陌生大鼠1 的时间显著短于对照组，探索空笼子的时间显著长于对照组（P＜0.05）；雄性大鼠探索陌生大鼠1的时间显著短于雌性（P＜0.05）；探索陌生大鼠1 的时间存在性别与组别的交互作用（P＜0.05）。Post hoc比较发现，VPA雌性大鼠探索陌生大鼠1的时间显著长于VPA 雄性大鼠。探索陌生大鼠1 和空笼子的次数（图2f），VPA 大鼠探索陌生大鼠1 的次数显著少于对照组，探索空笼子的次数显著多于对照组（P＜0.05）；雄性探索空笼子的次数显著高于雌性（P＜0.05）；探索空笼子的次数存在性别与组别的交互作用（P＜0.05）。Post hoc 比较发现，VPA雄性大鼠探索空笼子的次数显著多于VPA雌性大鼠。

3 讨论

本研究显示，VPA 大鼠总体发育水平均显著落后于对照组。除体重表现出性别差异，其他发育指标均无显著性别差异。行为测试中，我们的结果与以往相似［13］，VPA雄性大鼠显示出社交障碍和多动。同样的行为变化也表现在VPA 雌性大鼠。同时，VPA 组内表现出显著的性别差异，VPA 雄性大鼠表现的更多动，这与人类观察结果相似。但不同的是，VPA雄性大鼠比VPA雌性大鼠社交障碍表现的更明显。在水迷宫测试中，VPA 大鼠表现出学习记忆障碍。同时表现出性别差异，即VPA雄性大鼠的受损程度要高于VPA雌性大鼠。

研究显示VPA大鼠有明显的社交障碍。大鼠社交冲动减少和自发活动增加可能与焦虑升高有关，因为恐惧和焦虑对大鼠这些行为会产生深远影响［14］。VPA大鼠高架十字迷宫测试发现，VPA 雄性大鼠焦虑水平明显升高。众所周知，智力低下与孤独症密切相关［15］。VPA大鼠表现出的学习记忆障碍，可能与海马神经元损伤有关［16］。海马是学习记忆中枢，海马神经元损伤，会导致一系列行为和认知改变。前期研究发现，VPA 雌性大鼠海马CA1区的损伤要小于VPA雄性大鼠，这可能与雌性和雄性啮齿动物对有毒物质的抵抗力不同有关，同时表现出的行为也存在性别差异。可能与脑发育早期雌性和雄性对化学药剂易受性不同有关。这可能是导致某些疾病性别比例差异显著的重要原因。

图-2 VPA诱导孤独症模型大鼠行为测试结果

总之，本研究观察到VPA大鼠表现出发育和行为模式异常，并且与孤独症患者非常相似。同时也表现出显著的性别差异，这与孤独症不平衡的男女发病比例以及症状表现的性别差异相类似。虽然动物模型不能完全等同于人类疾病，然而，作为疾病研究的重要手段，动物模型研究仍然拥有广阔前景，需要不断完善。