亲本规格对中华绒螯蟹生殖性能和胚胎质量的影响

石今朝,姜晓东，刘乃更,成永旭，吴旭干

(1.上海海洋大学，农业农村部淡水种质资源重点实验室，上海 201306；2.上海海洋大学，水产动物遗传育种上海市协同创新中心，上海 201306；3.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；4.盘锦光合蟹业有限公司,辽宁盘锦 124200)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis,以下简称河蟹)是我国重要的经济蟹类，具有重要的养殖价值和食用价值[1]。河蟹人工养殖一般分为三个阶段，即幼体繁育阶段(初孵幼体至大眼幼体)、扣蟹养殖阶段(大眼幼体至扣蟹)和成蟹养殖阶段(扣蟹至成蟹)。自20世纪80年代初我国突破河蟹蟹苗人工繁育的关键技术以来，蟹苗生产技术已经有了长足的进步，蟹苗产量从1997年的65.00 t左右增加至2017年的843.89 t，并表现出进一步的增长趋势[2]。

科研人员和养殖户一直致力于河蟹亲本的有效管理及幼体繁育技术的开发应用。研究表明，河蟹胚胎质量直接影响着初孵幼体的质量[3-4]。而胚胎的质量取决于亲本优劣,Wu等[5]研究发现给河蟹亲本投喂含磷脂和中性脂高的饵料其胚胎孵化出的初孵幼体的头胸甲长和饥饿状态下的存活天数均显著高于对照组。此外，有学者认为部分育苗场为了降低育苗成本而使用小规格商品蟹作为亲本所繁育的子代养殖性状低劣，混入市场后易导致河蟹种质资源退化[6]。与之相反，大规格亲本所产幼体生长优势明显，但大规格亲本收购成本较高，且大规格抱卵蟹具有越冬成活率低和抱卵率不稳定等缺陷，往往给育苗生产者带来经济损失[7-8]。因此，出于对蟹苗繁育成本及最终收益的考虑如何挑选规格合适的亲本成为繁育场关注的重点问题。

迄今为止，国内外对不同规格甲壳动物的繁殖性能差异已有一定程度的研究，普遍认为亲本规格与其产卵量呈明显正相关[9-11]。河蟹作为我国重要的经济蟹类，有关其亲本规格与生殖性能关系的研究目前尚未见报道，虽蟹苗繁育过程中往往根据亲本规格及卵块大小估计其抱卵量，但缺少科学的量化指标。河蟹产卵后将其粘附于腹部，随母体进行卵内发育直至 Ⅰ 期溞状幼体后再将其排入水中，在此期间部分胚胎易因外界环境刺激而脱落甚至流产，为此本实验以临排幼之前的抱卵蟹为研究对象，探索亲本规格与其繁殖性能之间关系，以期进一步了解河蟹的繁殖生物学，为苗种生产过程中亲蟹的选择及育苗产量的估计提供理论参考 。

1 材料和方法

1.1 亲本来源及交配

河蟹亲本于2018年11月采自常州市金坛水产站河蟹养殖基地，均为经过育肥的二龄长江水系池塘养殖河蟹成体，其中母本体重为50～250 g，父本体重为80～300 g，实验用亲本均为肢体健全和有活力的个体。亲本活体运输至上海海洋大学如东河蟹遗传育种中心后，根据体质量将亲本分为四个等级进行后续实验，A：雌体50～80 g+雄体80～120 g；B：雌体100～130 g+雄体130～180 g；C：雌体150～180 g+雄体200～250 g；D：雌体200～240 g+雄体250～330 g，每组均挑选60只雌体和30只雄体；将各规格亲本分别放入四只条件相似的实验池塘(长×宽×深=14 m×11 m×2 m)中，池内海水盐度为18%左右，池四周设有防逃围网。亲本入池两天后开始投喂冰鲜带鱼，日投喂量为亲本体重的2%～5%，具体根据食台残饵和水温情况灵活调整。

2019 年 1 月中旬排干池塘水体，剔除交配池内所有雄蟹，同时检查雌蟹的抱卵情况，各组雌蟹的抱卵率均超过90%。由于河蟹冬季在池塘中有挖穴越冬的习性，因此需要认真检查和移除池塘所有洞穴内中的雄蟹。剔除雄蟹后，在各个实验池塘中分别加入海水后，让抱卵蟹在室外土池中自然越冬。根据河蟹的繁殖习性和对环境的要求，抱卵蟹越冬期间池塘水位要保持1.5 m以上，以确保池底环境相对稳定。

1.2 样品采集及生殖性能统计

2019年4月20日左右，从种蟹池随机挑选不同规格的抱卵蟹，抱卵蟹胚胎心跳均为100～150次/min，每个亲本规格均选择至少8只进行生殖性能研究。采样抱卵蟹，首先用镊子取出雌体腹部的所有卵块，进一步剔除卵块中的携卵附肢，然后采用电子天平(上海越平科学仪器有限公司，精确度为0.01 g)精确称取卵块重量(不含有携卵附肢)和剔除卵后的雌体体质量(不含腹部卵块)，雌体亲本去卵后平均体重和数量见表1。随后用游标卡尺(上海精美量具厂，精度0.01 mm)测量雌体壳长和壳宽。精确计数0.1 g左右卵块中的胚胎的数量，参照吴旭干等[12]的方法计算抱卵量、生殖力和生殖指数，计算公式如下：

PE=W/SWW

F=PE/WB

ER=100%×W/WB

公式中：PE为抱卵量(万/只)；W为抱卵蟹的卵块湿重(g)；SWW为单个胚胎湿重(g)；F为生殖力(个胚胎/克亲本体重)；ER为生殖指数(%)；WB为抱卵蟹净体质量(g,去卵后的质量)；

表1 不同规格河蟹亲本的平均体重及采集数量Tab.1 Mean body weight and amount of Chinese mitten crab broodstock

1.3 胚胎质量评价

在OLYMPUS显微镜下用目镜测微尺测量胚胎直径(精确到10 μm)，每只抱卵蟹测量100个胚胎。取胚胎3～4 mg(湿重)装入锡箔称量杯，用百万分之一天平准确称量总重，胚胎称重前需用碳酸氢氨等渗液冲洗和吸干表面水分，每只抱卵蟹重复测定3次，将称重后的湿胚胎和锡箔称量杯放入70度烘箱中烘干24 h，在干燥皿中冷却20 min左右精确称重[13]。将烘干的胚胎转移到培养皿中，可用蒸馏水或70 ℃酒精沾湿后，精确计算胚胎数量。然后，计算单个胚胎干重和单个胚胎湿重，计算方法如下：

SWW=WW/N

SDW=WD/N

式中：SWW代表单个胚胎湿重(μg)；WW代表称取的胚胎的湿重(μg)；N代表胚胎数量(个)；SDW代表单个胚胎的干重(μg)；WD代表称取的胚胎烘干后的质量(μg)；

按照AOAC[14]标准方法测定胚胎粗蛋白和灰分含量。采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量，在550 ℃下灼烧至恒重测定灰分含量；按照Folch等[15]的方法采用氯仿 ∶甲醇(V/V=2 ∶1)提取总脂并测定其含量；水分测定采用冷冻干燥法测定。

1.4 回归分析及数据分析

使用Excel软件绘制亲本规格与生殖性能的关系曲线。采用SPSS 24软件对实验数据进行统计分析，用Levene法进行方差齐性检验，当数据不满足齐性方差时对百分比数据进行反正弦或者平方根处理，采用 ANOVA对实验结果进行方差分析，采用Tukey’ s-b(K)法进行多重比较；当数据转换后仍不满足齐性方差时，采用Games-Howell进行非参数检验。所有数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，取P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 生殖性能差异

由表2知，随着亲本规格的增加，亲本抱卵量呈显著上升趋势；与之相反，亲本生殖力和生殖指数随着亲本的规格的增加而呈下降趋势，且其中仅A组亲本的生殖力和生殖指数显著较高。

表2 不同规格河蟹亲本繁殖性能差异Tab.2 Reproductive performance of Chinese mitten crab broodstock with different body weights

2.2 胚胎质量

表3显示：A组亲本的胚胎直径稍高于另外三组(5.30%～6.95%)，但各组间无显著差异；此外，不同规格河蟹亲本的单个胚胎湿重和单个胚胎干重分别为62.50 μg和11.35 μg左右，且各组间同样无显著差异。

表3 不同规格河蟹亲本胚胎直径和胚胎重差异Tab.3 Embryp diameter and weight of Chinese mitten crab broodstock with different body weights

各组蟹胚胎基于干重的常规生化组成如表4所示。 C组蟹胚胎水分含量显著低于另外三组，此外，A组粗蛋白和灰分含量均高于另外三组，其中A组粗蛋白含量与B、C两组差异显著。不同规格亲本所产蟹胚胎的总脂含量差异较小，均为18.00%左右。

表4 不同规格抱卵蟹的蟹胚胎常规生化成分比较Tab.4 Proximate composition of embryo of Chinese mitten crab broodstock with different body weights %干重

2.3 回归分析

所有实验亲本产卵量、生殖力和生殖指数与其体重、壳长和壳宽的回归分析结果如图1所示。图1中编号a、b、c所示的回归曲线为亲本体重与抱卵量、生殖力和生殖指数的关系，随着河蟹亲本体重的增加抱卵量呈快速上升趋势，大规格亲本的抱卵量明显高于小规格亲本的抱卵量，200 g左右亲本的抱卵量甚至能达到50 g左右亲本的抱卵量的3～4倍以上，然而，随着亲本体重的增加，亲本的生殖力和生殖指数显现出下降趋势。编号d～i分别是壳长、壳宽与抱卵量、生殖力、生殖指数的关系，随着亲本壳长与壳宽的增加，亲本的抱卵量明显增加，其生殖力和生殖指数呈下降趋势。从回归分析结果看，抱卵量与体重、壳长和壳宽的相关系数分别为0.72、0.74和0.73，生殖力与亲本体重、壳长和壳宽的相关系数分别为0.25、0.23和0.23，生殖指数与亲本体重、壳长和壳宽的相关系数分别为0.26、0.23和0.23。

图1 中华绒螯蟹体重、壳长和壳宽与生殖性能之间的关系Fig.1 Scatter plots of the relationships between broodstock size(body weight,carapace length and carapace width) and reproductive performance of Chinese mitten craba.体重与抱卵量；b.体重与生殖力；c.体重与生殖指数；d.壳长与抱卵量；e.壳长与生殖力；f.壳长与生殖指数；g.壳宽与抱卵量；h.壳宽与生殖力；i.壳宽与生殖指数

3 讨论

3.1 生殖性能差异

研究表明，甲壳动物亲本的生殖性能主要受到亲本营养状况、配对环境和产卵次数的影响[16-18]。本试验中所有亲本均为第1次抱卵，且均在相同的环境下交配、育肥及产卵，排除了抱卵次数、营养状况和环境因素对亲本的影响，因此可以在一定程度上反映亲本规格与生殖性能的关系。产卵量是评估甲壳动物生殖性能的重要指标，除部分生长过程中产卵多次的虾类外，甲壳动物产卵量一般随着体质量的增加而明显增加，该现象在本实验中也得到了证实[19]。生殖力指单位体重甲壳动物的产卵量，生殖指数指单位体重甲壳动物的卵块重，本研究中抱卵蟹的生殖力和生殖指数均随着亲本体质量的增加而下降，这可能与大规格河蟹亲本完成生殖蜕壳的时间晚性腺发育时间短有关，从而在繁育阶段表现为较低的生殖力和生殖指数[20]。此外，常国亮等[21]在研究小规格早熟河蟹的性腺指数时发现小规格河蟹雄蟹的性腺指数显著高于大规格正常成熟的雄蟹，推测这种现象与河蟹生长发育过程中的营养过剩有关。小规格河蟹具有更高的生殖力的原因也可能是其在进行蜕壳和生长时消耗的营养较少，在生殖生长时可以将更多的营养物质用于性腺的发育。

本研究中不同规格亲本的胚胎直径、干重和湿重均差异较小。结合之前研究中亲本营养状况对胚胎质量影响较小的研究结果可以发现，河蟹胚胎的重量和规格具有很强的保守性[12,22]。蛋白质和脂类是甲壳类胚胎发育过程中重要的能源物质，因此对胚胎生化组成的研究可以了解个体或组织对能源物质的储存和利用情况[23-24]。本研究中A组亲本(50～80 g)胚胎中粗蛋白明显高于其余各组，可以为胚胎发育以及幼体出膜提供更多能量。之前的研究表明胚胎中营养物质的含量主要受到产卵前母本营养物质的积累程度和胚胎发育过程中对营养物质利用的影响[25]，由此可见本实验中小规格母本在产卵前可能积累的营养物质较多，这与Wang等[26]在比较不同规格河蟹雄体营养品质实验中小规格个体性腺营养积累最为丰富的结果相一致。此外，蛋白质和脂类同样也作为河蟹初孵幼体的能量来源，并且蛋白质同时也是组成组织和器官的主要结构物质[3]，但是在实际生产中因大规格亲本本身所具备的优良形状且尚没有证据表明小规格亲本所产幼体的质量优于大规格亲本，繁殖场仍倾向于使用大规格亲本繁育苗种。本实验中不同规格亲本所产幼体的质量是否会因为胚胎中蛋白含量差异而同样存在差异，仍有待进一步研究。

3.2 回归分析

在虾蟹类的繁育中，往往很难直接测定其抱卵量，如何预测抱卵量则具有一定的应用价值。目前，普遍采用的方法是先建立雌蟹抱卵数量与体质量、壳宽或壳长等形态参数的数学关系式，而后只需要测量该蟹类相应的形态参数便可以计算出其抱卵数量。至今有关河蟹产卵量预测的研究尚无报道，但对于同属于甲壳蟹类的梭子蟹科的研究相对较多[27-29]。在本实验的回归分析的结果中显示，亲本抱卵量与其体重、壳长和壳宽均呈指数正相关，而亲本生殖力和生殖指数与其体重、壳长和壳宽成幂函数负相关，这与之前在部分甲壳动物上的研究结果相一致[29-30]。但这种线性关系也不是绝对的，李玉全等[31]和王仁杰等[32]研究表明三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)亲本体重与排幼量呈显著线性相关，而颜慧等[33]观察发现日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)的生殖力与体重和体长无明显的相关性，由此可见，不同学者建立的甲壳类生物学指标与抱卵量关系式不一样，表明建立关系式时所取样本的数量、大小、地域、时间等因素，以及试验操作均会影响抱卵量的最终预测。因此，在进行回归相关关系研究时，宜根据具体对象所获得的资料，用不同的函数类型拟合后，再进行比较，择其最优者。

从个体生殖性能与各生物学指标的回归方程可以看出，体重、壳长和壳宽均可以有效反映河蟹的生殖性能。但是对抱卵蟹称重不易操作，以体质量预测抱卵量的操作具有局限性，因此通过头胸甲宽或头胸甲长与抱卵量的回归方程估计抱卵量更为方便[28]。此外，河蟹的土池生态育苗过程中，Z1幼体的布苗密度为30万只/m3左右，亲蟹规格与产卵量的关系研究对于培育土池的需求量估算也具有重要的指导意义。但是幼体繁育过程中存在的部分未发育或发育不完全的死卵往往导致亲蟹排幼不完全，或部分亲蟹排幼过程中死亡致使部分幼体没有排出，可能会影响最终布苗密度的估算[34]。

综上，虽然小规格亲本抱卵量较少，但其生殖力、生殖指数及胚胎营养储存均显著高于大规格亲本。亲本抱卵量与体质量、壳长和壳宽具有良好的相关性，相关系数分别达到0.72、0.74和0.73，因此可以通过亲本规格有效估计不同规格亲本的生殖性能，为生产实践中河蟹亲本的选择提供理论参考。关于不同规格亲本所产幼体的质量是否存在差异，尚待进一步研究 。