长江口中华绒螯蟹雌蟹抱卵前后能量代谢酶的变化

姬 慧，冯广朋，黄晓荣，耿 智，庄 平

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海长江口渔业资源增殖和生态修复工程技术研究中心，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 200090)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)隶属于甲壳纲绒螯蟹属，是一种具有洄游习性的水生经济物种，主要在长江流域等淡水水域栖息生长，性成熟后洄游到长江河口浅海水域完成交配产卵。由于环境污染、生境破坏、过度捕捞等原因，上世纪八十年代后中华绒螯蟹天然资源急剧衰退[1]。为了满足群众餐饮需要，九十年代以后中华绒螯蟹人工繁殖和池塘养殖逐步兴起，目前我国中华绒螯蟹养殖产量已达4×105t。繁殖期是动物延续种群的重要生活史阶段，产卵活动不仅对动物自身的能量需求较高，而且对其代谢生理亦有显著影响。能量代谢是机体供能的根本途径，相关酶活力降低以及代谢中间产物的缺失将阻断新陈代谢通路，从而对生物体能量的供应造成影响。因此，能量代谢酶可在一定程度上反映动物体内的能量代谢水平[2]。

目前有关中华绒螯蟹繁殖期的研究主要集中在营养品质[3]、遗传育种[4]、产卵场分布[5]、食性[6]、增殖放流[7,8]等方面，而对繁殖期中华绒螯蟹能量代谢酶调节的研究较少。本研究以中华绒螯蟹天然群体和养殖群体为实验对象，测定分析了抱卵前后中华绒螯蟹的性腺、肝胰腺、肌肉等组织中能量代谢酶[己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脱氢酶(PK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、精氨酸激酶(AK)]活力的变化，旨在为探讨中华绒螯蟹繁殖期能量代谢调节机制、提升人工养殖技术、促进天然种群资源保护等提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

中华绒螯蟹天然群体抱卵前雌蟹采自江苏镇江长江干流水域(32.11°N，119.27°E，淡水)，抱卵后雌蟹采自长江口横沙浅滩水域(31.23°N，121.57°E，盐度为15)；养殖群体抱卵前雌蟹来自于江苏省太湖水域(淡水)，抱卵后雌蟹来自于江苏省南通市人工繁殖群体(盐度为16)。抱卵前雌蟹和抱卵后雌蟹的采集时间分别为2018年11月和2019年1月。

养殖群体抱卵前雌蟹平均体重为(100.43±8.64) g，平均壳长为(54.63±1.31) mm，平均壳宽为(60.25±1.29) mm；抱卵后雌蟹(受精卵期)平均体重为(116.18±7.21) g,平均壳长为(55.38±1.41) mm，平均壳宽为(61.87±2.10) mm。天然群体抱卵前雌蟹平均体重为(60.91±17.95) g，平均壳长为(47.45±5.08) mm，平均壳宽为(52.45±5.45) mm；抱卵后雌蟹平均体重为(113.88±14.29) g，平均壳长为(55.20±2.25) mm，平均壳宽为(61.40±2.36) mm。

1.2 样品采集和测定

每个实验组选出体重相近、个体健壮、附肢完整的个体各15只。在冰盘上对每只蟹进行解剖，分别取出肝胰腺、肌肉、性腺等组织，迅速放入液氮中进行冷冻，再放入-80 ℃冰箱保存待测。酶活性测定前取出肝胰腺、肌肉和性腺组织，每个组织分别测定HK、PFK、PK、SDH、MDH、AK等6种酶的活性，酶活性测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，测定方法按照试剂盒操作步骤进行，抱卵前雌蟹测定的试剂盒批号均为20190112，抱卵后雌蟹测定的试剂盒批号均为20190215。

取剪碎的组织样品约0.2 g，将其放入玻璃匀浆管中，首先加入1.8 mL 0.90%的生理盐水，利用匀浆机进行匀浆；然后用Allegra X-22R型冷冻离心机3000 r/min离心10 min；最后稀释到10%组织匀浆进行测定。HK、PK、PFK、MDH、SDH等酶活力测定使用UNICO-UV2000分光光度计，选用340 nm波长，采用0.5 cm光径石英比色皿；AK活力测定采用铋钼磷三元杂多酸体系定磷法。酶活性测定时使用华东电子DG5033A酶标仪，选用450 nm波长。总蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法。

1.3 数据处理

用 MS Excel 2016进行数据统计，采用SPSS 18.0软件的配对样本T检验和独立样本T检验及单因素方差分析(one-way ANOVA)，分析养殖群体和天然群体抱卵前后中华绒螯蟹各个组织中不同酶活性的差异显著性，差异显著性用P<0.05表示。

2 结果与分析

2.1 抱卵前后雌蟹糖酵解酶活性变化

雌蟹抱卵前肝胰腺和肌肉组织中HK活性显著高于抱卵后。抱卵前后肝胰腺和肌肉组织中PFK活性无显著差异。雌蟹抱卵前肝胰腺组织中PK活性显著高于抱卵后，而抱卵前肌肉组织中PK活性显著低于抱卵后。在性腺组织中，野生群体抱卵前HK活性(7.30±30.06 U/mg)显著高于养殖群体(1.89±0.35 U/mg)，但野生群体抱卵前PFK和PK活性均显著低于养殖群体(表1)。

表1 天然和养殖群体糖酵解酶活性的变化Tab.1 Changes of glycolytic enzymes activity of wild-caught and pond-reared populations

2.2 抱卵前后雌蟹三羧酸循环酶活性变化

雌蟹抱卵前肝胰腺组织中SDH活性高于抱卵后，但差异不显著；抱卵前肌肉组织中SDH活性显著高于抱卵后。雌蟹抱卵前肝胰腺组织中MDH活性显著高于抱卵后，而抱卵后肌肉组织中MDH活性显著高于抱卵前。在性腺组织中，养殖群体抱卵前SDH与MDH活性显著高于野生群体(表2)。

表2 天然和养殖群体三羧酸循环酶活性的变化Tab.2 Changes of tricarboxylic acid cycle enzymes activity of wild-caught and pond-reared populations

2.3 抱卵前后雌蟹AK活性变化

雌蟹抱卵前肝胰腺组织中AK活性显著高于抱卵后，而抱卵后肌肉组织中AK活性显著高于抱卵前。在性腺组织中，养殖群体抱卵前AK活性(0.14±0.01) U/mg,显著高于养殖群体(0.12±0.01) U/mg(表3)。

表3 天然和养殖群体精氨酸激酶活性的变化Tab.3 Changes of the arginine kinase activity of wild-caught and pond-reared populations

3 讨论

3.1 糖酵解酶活性抱卵前后的差异

糖酵解途径的主要限速酶是HK、PFK和PK，其中HK催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖[9]，PFK是衡量碳水化合物利用的重要代谢酶[10]，PK在糖酵解中催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP[11]。本研究中华绒螯蟹天然群体肝胰腺和肌肉组织中，抱卵前雌蟹HK活性显著高于抱卵蟹，而抱卵前后PFK活性无显著差异，表明抱卵前雌蟹比抱卵后利用葡萄糖的能力更强。中华绒螯蟹在长江口洄游过程中，需要适应河口水域盐度的变化。雌蟹在抱卵前通过促进体内葡萄糖代谢，可以为维持体内渗透压的平衡提供充足能量[12]。而当雌蟹抱卵后，处于等渗点状态时用于维持渗透压平衡的能量会相对较少，体内的酶活性会相应降低[13]。肝胰腺和肌肉是甲壳动物储存肝糖原和肌糖原的重要组织[14-16]。本研究中天然群体抱卵前雌蟹肝胰腺组织中PK活性显著高于抱卵蟹，而肌肉中PK活性与肝胰腺相反，表明抱卵前雌蟹以肝胰腺中糖酵解产生的能量供能，而抱卵后肌肉组织中糖酵解产生的能量供给增加。原因是抱卵后雌蟹使用螯足在腹部卵粒周围持续拨动水流，有利于胚胎快速发育[17]，从而导致肌肉中PK活性高于抱卵前雌蟹。本研究亦表明，养殖群体雌蟹抱卵前后肌肉中PK活性的变化规律与天然群体结果一致，两个群体存在同样的变化规律。

3.2 三羧酸循环酶活性抱卵前后的差异

SDH和MDH是三羧酸循环途径中调控脱氢反应的关键酶[18]，可在一定程度上反映水生生物的有氧代谢水平[19]。本研究表明，天然群体雌蟹抱卵前肌肉SDH活性和肝胰腺MDH活性显著大于抱卵后，表明抱卵前雌蟹肝胰腺组织有氧代谢比抱卵后更强，这可能是由于抱卵前雌蟹需要将体内积累的大量营养物质氧化分解，从而释放充足能量用于产卵繁殖活动[20]。有研究亦表明，中华绒螯蟹雌性亲蟹在生殖洄游过程中主要以脂肪作为供能物质，代谢率与能量消耗逐渐降低[21]。与肝胰腺组织不同，天然群体雌蟹抱卵后肌肉组织MDH活性显著高于抱卵前，这是因为雌蟹抱卵后使用螯足在腹部卵粒周围持续拨动水流，有利于胚胎发育，从而增强了肌肉的有氧代谢，使能量代谢水平升高。本研究结果表明，养殖群体雌蟹在抱卵前后的肝胰腺和肌肉的SDH与MDH活性变化趋势与天然群体一致，这也说明了雌蟹抱卵前肝胰腺组织有氧代谢高于抱卵后，抱卵后肌肉组织有氧代谢高于抱卵前。

3.3 精氨酸激酶活性抱卵前后的差异

AK是无脊椎动物体内调节能量代谢的重要酶之一[22]，可为调节渗透压平衡提供能量[23]。本研究中天然群体雌蟹抱卵前肝胰腺组织AK活性显著高于抱卵后，这是因为抱卵前雌蟹生活在淡水水域，而抱卵后雌蟹生活在咸水水域，雌蟹在向长江口生殖洄游过程中，需要产生和提供更多能量来调节体内渗透压平衡，这与Serrano等[24]和Kinsey等[25]关于蓝蟹(Callinectessapidus)的研究结果一致；另一方面，天然群体抱卵蟹肌肉组织中AK活性显著高于抱卵前雌蟹，是因为抱卵蟹在腹部胚胎快速发育时，需要加强螯足在胚胎周围水流的拨动从而，增加了肌肉的能量消耗。Grieshaber等[26]研究表明，AK活性与肌肉细胞运动过程中的能量持续产生密切有关，雌蟹肌肉组织的持续运动，需要提高AK酶的活性促进新陈代谢和能量物质分解。本研究中，养殖群体雌蟹抱卵前后肌肉组织中AK活性与天然群体雌蟹的变化趋势一致，两个群体存在同样的变化规律。

4 结论

在肝胰腺组织中，天然群体和养殖群体抱卵前雌蟹都通过提高糖酵解酶、三羧酸循环酶和精氨酸激酶活性，提升体内能量的供应水平，用于产卵繁殖等机体活动的需要；而在肌肉组织中，两个群体抱卵后雌蟹都通过提高糖酵解酶、三羧酸循环酶和精氨酸激酶活性水平，用于胚胎孵化、拨动水流等机体活动的需要。两个群体雌蟹抱卵前都通过促进葡萄糖的利用和增加能量的供应，来调节机体自身的渗透平衡。HK、PFK、PK、SDH、MDH和AK活性都呈现出组织差异性，在能量代谢中发挥特定作用。因此，在人工养殖和增殖放流中华绒螯蟹时，可增加优质饵料供应，强化亲蟹体内脂类、蛋白质[27,28]等积累，促进其性腺发育和提升增养殖综合效益。