基于MALDI-TOF MS技术对加州鲈病原弗氏柠檬酸杆菌的快速鉴定

谢海平,喻佳俊,黄 清,黄木珍,廖凯儒,李绪鹏,黄泽彬,李佰通，刘 平，李 磊

(1.广东省渔业技术推广站，广州 511455；2.暨南大学质谱仪器与大气环境研究所，广州 510632；3.广州禾信康源医疗科技有限公司，广州 510530)

2020年3月初，广州某水体养殖场的加州鲈(Micropterussalmoides)出现身体溃烂发病死亡情况，死亡率2%～3%，初步检查主要症状为：反应迟钝、摄食量减少，直至拒食，鳃上黏液有增多现象，身体多处有溃烂斑，溃烂斑周围发红肿胀，肝脏有白色斑点。镜检鳃部和体表未发现寄生虫。为快速明确疾病原，本研究利用自制的MALDI-TOF MS[9]对从患病加州鲈鱼体上分离到的病原菌进行鉴定，并与自动微生物鉴定系统法进行了鉴定对比，以期确定MALDI-TOF MS是否能对水生动物病原菌进行快速鉴定，并为水生动物疾病治疗或水体环境修复改善提供有效的策略和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

患病加州鲈取自广州某养殖场，均重1 500 g/尾，体长为40～50 cm。

1.2 试剂与仪器

脑心浸液琼脂(BHI)培养基(北京陆桥技术有限责任公司)、微生物革兰氏染色检测配套试剂(广东环凯微生物科技有限公司)、药敏纸片(杭州天和微生物试剂有限公司)、大肠埃希菌ATCC 8739标准菌株蛋白提取液(广州禾信康源医疗科技有限公司)、α-氰基-4-羟基肉桂酸、70 %甲酸、乙腈、三氟乙酸；自制的MALDI-TOF MS CMI-1600[9]，较国内外同类型仪器相比，其采用近零斜影光路入射、双脉冲宽质量范围聚焦创新技术以及高频固体激光器，具有高分辨率、高灵敏度和高检测速率等优势；LRH-250生化培养箱(韶关市明天环保仪器有限公司)；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统(法国生物梅里埃)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分离培养

对患病的加州鲈进行解剖，用接种环分别在肝脏、肾脏、脾部、尾部的肿囊等部位取样，并划线接种于脑心浸液琼脂(BHI)培养基中，置于30 ℃恒温箱中培养24 h。

1.3.2 质谱鉴定

MALDI-TOF MS对微生物鉴定基本流程分为样品制备、质谱检测、谱图鉴定三个步骤。

(1)样品制备

采用两种方法进行样品制备。第一种为直接涂抹法：用1 μL的接种环挑取BHI培养基培养出的单菌落，均匀涂抹在不锈钢样品靶上，利用覆盖法点1 μL基质。基质溶液制备方法为将10 mg的CHCA基质溶解在1 mL含有50%乙腈和2.5%TFA的溶液中，制备成过饱和的CHCA基质溶液。第二种为甲酸破壁法：用1 μL的接种环挑取BHI培养基培养出的单菌落，均匀涂抹在不锈钢样品靶上，而后覆盖1 μL 70 %的甲酸，待甲酸自然晾干后，利用覆盖法点1 μL基质。在同一样品靶点1 μL大肠埃希菌ATCC 8739蛋白提取液，覆盖1 μL基质。

(2)质谱检测

样品制备完成后便可进行质谱检测，MALDI-TOF MS采用正离子模式，加速电压为22 kV，质量范围设置为2 000～20 000 Da。采集模式为自动采集，激光能量根据质谱信号强度和谱图分辨率自动调谐，每个靶点采集400张有效单谱，而后累加成一张谱图，累加后的谱图通过平滑、降噪、峰提取等处理后用于鉴定。根据GB/T 33682-2017基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则，利用大肠埃希菌ATCC 8739蛋白提取液进行谱图校准。

(3)谱图鉴定

得到的质谱图经过平滑、基线处理等操作后，与数据库中的蛋白质指纹图谱进行对比分析，最终鉴定出微生物属种。

1.3.3 生化法鉴定

从步骤(1)中培养好的平板上挑取纯菌落，制备0.5麦氏单位浓度的菌悬液，利用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统及其配套的GN鉴定板进行鉴定。

1.3.4 药敏实验

将少量细菌接于9‰灭菌后的生理盐水，让菌液的浓度达到0.5个麦氏浊度，将菌液涂到平板上，贴上药敏纸片。将其置于30 ℃培养箱中培养24 h。

2 结果

2.1 患病鱼种

患病的加州鲈如图1所示，鱼身和鳃盖有明显的溃烂痕迹，有囊肿，并且口腔、鳍部有充血点。解剖后，可从鱼肝表面发现被感染的白色小斑点。

图1 被感染患病的加州鲈Fig.1 Infected Micropterus salmoides

2.2 细菌形态

分离出的样本经过24 h培养后，在BHI培养基中生长出的细菌菌落呈现为橙黄色，圆形，边缘整齐，湿润，表面光滑，菌落凸起，单菌落直径为2～3 mm。经革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌，形状为短杆状。

2.3 鉴定分析

利用自制的MALDI-TOF MS对分离培养出的细菌进行质谱鉴定，所采集到的质谱图如图2所示，由图可知直接涂抹法和甲酸破壁法得到的谱图质谱峰信号清晰明了具有一致性，质量范围集中在2 000～10 000 Da内，但甲酸破壁法得到的峰信号强度要优于直接涂抹法，是由于甲酸破壁法能够提取到更多的微生物核糖体蛋白，使得峰强度增加。

图2 自制MALDI-TOF MS采集到的细菌质谱图Fig.2 Mass spectra of bacteria by MALDI-TOF MS9分以上表示结果高度可信，8分以上表示结果可信，6.4～8分表示结果可参考，6.4分以下表示无鉴定结果或结果不可信

通过将所得谱图与数据库中的指纹图谱进行对比分析，质控菌和样品均被成功鉴定出。质控菌鉴定结果为大肠埃希菌，分离培养出的待测菌鉴定结果为弗氏柠檬酸杆菌。两种前处理方法对鉴定结果无区别，结果均高度可信，分值在9.2分以上。其中一个样品的鉴定界面如图3所示，为弗氏柠檬酸杆菌样品质谱峰与数据库中的质谱峰匹配情况，其鉴定结果通过质谱峰的匹配情况算出。

利用基于生化法的全自动微生物鉴定仪对菌落进行确认鉴定。甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、邻硝基苯-半乳糖苷、硫代硫酸钠、脲素、KCN试验结果为阳性。赖氨酸、色氨酸、明胶试验结果为阴性。根据伯杰细菌鉴定手册标准菌株的生理生化特征，分离菌株与弗氏柠檬酸杆菌生化表现一致，判读该菌株为弗氏柠檬酸杆菌。

2.4 药敏实验

药敏结果如表1所示，该株弗氏柠檬酸杆菌对新霉素、链霉素、氟苯尼考、诺氟沙星等药物较敏感，对环丙沙星和大观霉素低度敏感，对强力霉素、红霉素等有耐药性。根据药敏实验结果，对发病的加州鲈利用氟苯尼考进行治疗，用药后病情得到有效控制。

表1 药敏试验结果Tab.1 Results of drug sensitivity test

图3 弗氏柠檬酸杆菌的样品谱峰与数据库中的谱峰匹配情况Fig.3 Match of sample peaks of Citrobacter Freundii with mass spectrum database样本未匹配表示样本质谱峰信息与数据库峰信息不一致；样本匹配表示样本质谱峰与数据库中的质谱峰结果一致；结果匹配表示数据库中的峰信息与样本峰结果一致；结果未匹配表示数据库中的峰信息与样本峰信息不一致

3 讨论

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)属于肠杆菌科柠檬酸杆菌属，是一种革兰氏阴性短杆菌,在自然界分布广泛，是人和动物肠道中的正常菌种，但也具有致病性[10]。大量研究表明弗氏柠檬酸杆菌对水体中的鱼类[11-14]、虾蟹[15-21]、龟鳖[22,23]、大鲵[24-27]等动物具有致病性，可引起机体水肿，严重时致死。而这些研究采用的微生物鉴定方法为基于生化法的全自动微生物鉴定系统或16S rRNA测序法，鲜有利用MALDI-TOF MS对水产动物致病弗氏柠檬酸杆菌的研究案例。

本研究从患病加州鲈分离出的优势菌株经MALDI-TOF MS和全自动微生物鉴定系统两种方法进行鉴定，鉴定结果均为弗氏柠檬酸杆菌，两种方法对比如表2所示，由表2可知生化法鉴定耗时大于6 h，而质谱鉴定法耗时仅5 min。从耗材价格上看，生化鉴定法是质谱法的20倍。质谱法在鉴定耗时、价格和操作复杂性方面明显优于生化法。结果表明MALDI-TOF MS对水生动物致病细菌具有快速鉴定的能力，有助于对水产养殖病害进行快速有效地治疗。

表2 质谱鉴定法和生化鉴定法对比情况Tab.2 Comparison of mass spectrometry methods and biochemical methods