不同耐药性鲍曼不动杆菌耐药特征及常见耐药基因检测分析*

林雪霏，蒋月婷，邓颖珊，赖斯华，寇晓霞，吴爱武△

(1.广州医科大学，广东广州 510182;2.中山大学热带病防治研究教育部重点实验室，广东广州 510080;3.广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510230)

鲍曼不动杆菌是一种非发酵革兰阴性杆菌，是医院获得性感染的重要机会致病菌，可引起各种感染，包括呼吸机相关性肺炎、尿路感染、皮肤伤口感染、菌血症和脑膜炎等[1-2]。随着广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂及各种侵入性治疗的广泛使用，近年来，多重耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌在医院感染中的检出率不断增加，这类细菌的耐药特点、致病力等也成为临床研究热点。本研究通过对不同耐药性鲍曼不动杆菌的耐药和生物膜基因进行检测和分析，以期了解本地区该类细菌的耐药表型和耐药基因特点，为临床防控和抗感染治疗提供实验室基础。

1 材料与方法

1.1菌株来源 在广州医科大学附属第一医院微生物室菌种库收集2016年1月至2018年12月临床分离的鲍曼不动杆菌共110株。

1.2仪器与试剂 VITEK2 Compact全自动微生物分析系统购自法国生物梅里埃公司，PCR仪购自美国BIO-RAD公司；G∶BOX凝胶成像系统购自信基国际贸易有限公司；双向电泳分析仪购自北京六一仪器厂；高压灭菌锅购自江阴滨江医疗设备有限公司；营养琼脂购自广州环凯微生物科技有限公司；PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；电泳琼脂糖(Biowest)购自上海莼试生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定和药敏试验 110株收集菌株经VITEK2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定和药敏分析。随后再用PCR法检测鲍曼不动杆菌特有的分子标记blaOXA-51-like基因，进一步确认110株菌株均为鲍曼不动杆菌，其中多重耐药菌42株，泛耐药菌43株，相对敏感菌25株。多重耐药鲍曼不动杆菌定义为对10类抗菌药物中3类或者3类以上药物不敏感的鲍曼不动杆菌；泛耐药鲍曼不动杆菌定义为对10类抗菌药物中8类或者8类以上药物不敏感的鲍曼不动杆菌；其余菌株都归类为相对敏感鲍曼不动杆菌。

1.3.2常见耐药基因和生物膜基因的检测 采用煮沸法提取细菌DNA。25.0 μL反应体系：预混液12.5 μL，模板2.0 μL，10.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，灭菌双蒸水补足体积。引物序列合成及扩增条件参考文献[3-7]，引物序列见表1、2。在各基因阳性的菌株中分别各取1株菌株，将其相应PCR扩增产物进行纯化并测序，测序结果提交到GenBank在线数据库，应用比对工具BlastN进行比对。

表1 鲍曼不动杆菌常见耐药基因引物序列及产物长度

表2 鲍曼不动杆菌常见生物膜基因引物序列及产物长度

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件进行数据处理及统计分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同耐药性菌株的构成比和药敏分析结果 110株鲍曼不动杆菌中，相对敏感菌25株，占22.7%(25/110)，相对敏感菌对大部分测试药物敏感，这些菌株对头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦和环丙沙星均敏感。而多重耐药菌42株，占38.2%(42/110)，多重耐药菌对测试的抗菌药物多表现为耐药，耐药率最低的是替加环素，为11.9%，其余抗菌药物耐药率均大于55.0%，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为92.9%、95.2%，对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为95.2%。泛耐药菌43株，占39.1%(43/110)，泛耐药菌对抗菌药物高度耐药，耐药率最低的是替加环素，为4.7%，对其余抗菌药物耐药率均大于85.0%，对妥布霉素、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、氨曲南和环丙沙星均耐药。

2.2常见耐药基因检测结果 在110株鲍曼不动杆菌中，耐药基因TEM和adeB具有较高检出率，分别为64.5%、73.6%(均>50.0%)，未检出耐药基因parC。在25株相对敏感菌中，耐药基因gyrA和adeB检出率分别为40.0%和56.0%；在42株多重耐药菌和43株泛耐药菌中，耐药基因TEM和adeB具有较高检出率，多重耐药菌的检出率分别为88.1%和92.9%，泛耐药菌的检出率分别为76.7%和65.1%。见表3。

表3 不同耐药性鲍曼不动杆菌常见耐药基因的检出情况[n(%)]

对比不同耐药性的鲍曼不动杆菌耐药基因的检出情况，多重耐药菌的TEM、armA、adeB耐药基因检出率比相对敏感菌高，差异有统计学意义(P<0.05)。泛耐药菌的TEM耐药基因检出率比相对敏感菌高，差异有统计学意义(P<0.05)。相对敏感菌株的gyrA耐药基因检出率比泛耐药菌株高，差异有统计学意义(P<0.05)。多重耐药菌的gyrA、armA、adeB耐药基因检出率比泛耐药菌高，差异有统计学意义(P<0.05)。

携带TEM基因的71株菌株除对替加环素外，对其他抗菌药物的耐药率均大于70.0%；携带PER基因的3株菌株除对复方磺胺甲噁唑、替加环素和左氧氟沙星外，对其他抗菌药物的耐药率均大于60.0%；携带gyrA基因的25株菌株除对妥布霉素、阿米卡星、复方磺胺甲噁唑和替加环素外，对其他抗菌药物的耐药率大于50.0%；携带armA基因的15株菌株除对替加环素外，对其他抗菌药物的耐药率均大于60.0%；携带adeB基因的81株菌株除对替加环素外，对其他抗菌药物的耐药率大于60.0%。见表4。

表4 110株携带不同耐药基因鲍曼不动杆菌的耐药率(%)

2.3常见生物膜基因检测结果 在110株鲍曼不动杆菌生物膜基因检测结果中，除了bla-PER1基因以外，AbaI、Csu E 、Csu C、Csu D、Omp A、surA1、Pld、paaE基因的检出率均较高(>65.0%)。多重耐药菌和泛耐药菌的paaE生物膜基因检出率比相对敏感菌高，差异有统计学意义(P<0.05)。多重耐药菌的surA1生物膜基因检出率比泛耐药菌高，差异有统计学意义P<0.05)。见表5。

表5 不同生物膜基因在不同耐药性鲍曼不动杆菌中的检测结果[n(%)]

3 讨 论

近年来，由于抗菌药物的滥用，鲍曼不动杆菌在国内外出现多重耐药，甚至泛耐药的报道不断增多。根据中国细菌耐药监测网(CHINET)对2005-2017年临床常见病原菌分离及耐药监测结果显示，不动杆菌属细菌耐药率及增长率均居首位，2017年鲍曼不动杆菌对亚胺培南及美罗培南耐药率均已大于60%，并且在多地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药率大于80%，最高可达91.7%，已经呈现耐药暴发状态，导致临床治疗困难，感染病死率增加[8]。世界卫生组织已将对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌列入对人类健康构成最大威胁细菌的关键组中，从而优先研究和开发治疗鲍曼不动杆菌感染的方法[9]。由于抗菌药物使用习惯的不同，同一种细菌在不同地区的耐药表现和耐药机制可能有差异，因此，实验室通过研究分析及时掌握本地区细菌的耐药特点和规律，对指导临床合理用药有重要意义。

本研究的110株鲍曼不动杆菌中，相对敏感菌只占22.7%，而多重耐药菌和泛耐药菌分别占38.2%和39.1%，后两者合计占77.3%，说明临床分离的鲍曼不动杆菌中绝大部分菌株都是耐药菌株。对3类不同耐药性的菌株进行药敏结果分析，其中25株相对敏感菌对绝大部分药物敏感。42株多重耐药菌对多类抗菌药物高度耐药，除替加环素以外，对其余抗菌药物耐药率均大于55.0%，其中对亚胺培南和美罗培南的耐药率均大于90.0%。43株泛耐药菌对绝大部分抗菌药物高度耐药，其中包括妥布霉素、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、氨曲南和环丙沙星。这些结果提示，对临床分离的鲍曼不动杆菌，其抗感染治疗方案的确定需慎重对待，必须综合分析实验室、临床科室等部门的信息再应用。

鲍曼不动杆菌耐药发生的机制复杂，包括：(1)产生一种或多种水解酶或钝化酶，如超广谱 β-内酰胺酶等，从而对β-内酰胺类抗菌药物耐药；(2)抗菌药物作用靶位的改变，如产生16S rRNA 甲基化酶导致对氨基糖苷类耐药；(3)细菌主动外排系统的过度表达，adeABC是鲍曼不动杆菌中主要和特有的多重耐药外排泵，其中adeB起主要介导作用，主要介导对氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗菌药物的耐药[10-11]。由于基因支持着细菌的基本构造和性能，绝大部分情况下细菌的耐药表型均受基因控制，因此，本研究对收集的菌株进行了常见耐药基因的检测，以便了解本地区该类细菌常见耐药基因携带情况，结果显示，adeB耐药基因的检出率最高，为73.6%，提示本地区分离菌株的主动外排系统过度表达是其产生耐药性的原因之一。对不同耐药性鲍曼不动杆菌耐药基因检出结果进行比较，多重耐药菌的TEM、armA、adeB耐药基因检出率比相对敏感菌高；泛耐药菌的TEM耐药基因检出率同样比相对敏感菌高。以上结果提示，鲍曼不动杆菌转变为多重耐药菌可能与其携带TEM、armA、adeB耐药基因有关，而成为泛耐药菌可能与其携带TEM耐药基因有关。鲍曼不动杆菌一旦对碳青霉烯类药物耐药，往往会对头孢菌素类、青霉素类、喹诺酮类等抗菌药物也耐药，表现为多重耐药，甚至泛耐药[12]。本研究携带不同耐药基因菌株的耐药谱不完全相同，对大多数抗菌药物的耐药率超过60.0%。在超广谱 β-内酰胺酶基因TEM和PER检出菌株中，除对替加环素外，携带基因TEM菌株对抗菌药物耐药率均比携带基因PER菌株耐药率高，提示携带TEM基因的菌株更容易导致对抗菌药物耐药。因此，临床医生应根据药敏结果合理用药，杜绝抗菌药物的滥用，防止耐药菌播散流行。

生物膜是构成细菌侵袭力的重要因子，其在细菌的黏附、感染、耐药性与耐药基因的传递、逃避宿主免疫反应等方面具有重要作用[13]。生物膜形成是一个复杂的过程，需要许多因素协同作用，例如外膜蛋白A(OmpA)、blaPER-1、CsuA/BABCDE伴侣-菌丝菌毛组装系统，以及铁的吸收机制(铁螯合分子、BasD和BauA)[14-15]。不同的生长条件会影响生物膜的形成，如温度、pH值、营养成分和光照等。有研究表明，鲍曼不动杆菌在28 ℃温度条件下比在37 ℃温度条件下的生物膜形成能力强，慢生长的细菌并不会使其生物膜形成能力减弱[16]。本研究结果显示，在决定鲍曼不动杆菌生物膜形成的因素中，除了bla-PER1基因以外，AbaI、Csu E 、Csu C、Csu D、Omp A、surA1、Pld、paaE基因的检出率均较高(>65.0%)，表明大多数临床分离的鲍曼不动杆菌具有潜在生物膜形成能力。而多重耐药菌和泛耐药菌的paaE生物膜基因检出率比相对敏感菌高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明菌株携带paaE生物膜基因可能与其多重耐药或者泛耐药有关。

4 结 论

临床分离的鲍曼不动杆菌中绝大多数菌株均具有不同程度耐药性，应引起临床医生重视，对这类细菌感染患者需根据药敏结果合理用药；本研究所有菌株中耐药基因adeB的检出率最高，提示本地区分离株的主动外排系统的过度表达是其产生耐药性的原因之一，多重耐药菌最常检出的耐药基因是TEM、armA和adeB，泛耐药菌中最常检出的耐药基因是TEM和adeB； 临床分离的鲍曼不动杆菌可检出多种生物膜基因，具有潜在生物膜形成能力，生物膜基因paaE的携带可能在菌株多重耐药和泛耐药菌中起一定作用。