MALDI-TOF MS直接检测清洁中段尿液标本中病原菌的价值*

徐令清,张冈毅,钟子莹,温伟洪,汤英贤,钟国权,李介华,刘丽忠

(广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院检验科，广东清远 511518)

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)是一种新型的软电离生物质谱仪，对临床微生物的细菌鉴定具有非常大的作用，不仅能快速鉴定纯菌落，还能直接从临床标本中检测细菌，不需培养，只需进行简单的预处理，如离心、血细胞溶解等，还可以进行分子水平的基因分型、药物敏感性分析和无菌体液的直接鉴定等。目前，临床主要依靠传统手工法及自动化鉴定仪检测病原微生物，传统的技术具有周期长、费用高、鉴定能力有限和信息滞后的缺陷。但MALDI-TOF MS能够完成微生物多种成分的分析，包括蛋白质、脂类、多肽等[1]。MALDI-TOF MS技术应用于细菌的鉴定，实际上就是检测具有属、种或亚型特异性的生物标志物质量信号，它主要通过分析不同细菌具有的不同蛋白质指纹图谱，对鉴定结果与数据库中已知的细菌进行比对，得出各种细菌鉴定结果。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2018年10月至2019年3月本院住院及门诊患者的清洁中段尿液标本共300份。

1.2仪器与试剂 仪器：MALDI-TOF MS购自德国布鲁克公司，Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统(Vitek 2 Compact)购自法国生物梅里埃公司，BD phoenixM50全自动微生物分析系统(BD M50)购自美国BD公司，T100TMPCR扩增仪、电泳仪、Gel DoxTM XR+凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司。试剂：MALDI-TOF MS所用试剂包括三氟乙酸、色谱级乙腈、70%甲酸和无水乙醇，均为厂家配套试剂。哥伦比亚血琼脂平板购自广州迪景微生物科技有限公司；细菌DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、Gel Red核酸染料和Marker DNA Ladder购自北京天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1尿液标本培养 采用10 μL的接种环将中段尿液标本接种于哥伦比亚血琼脂平板上，37 ℃ CO2培养箱培养18～24 h。

1.3.2尿液标本质谱分析前处理 取10 mL的尿液标本倒入无菌的15 mL离心管中，以2 000 r/min转速离心4 min，去除蛋白。离心完毕后，将上清液倒入另外一支无菌的15 mL离心管中，在20 ℃下以12 000 r/min离心5 min。弃上清液，在沉淀中加入1 mL 0.45%氯化钠注射液，转到1.5 mL的EP管中，充分振荡混匀后12 000 r/min离心5 min。弃上清液，用1 mL去离子水洗涤沉淀，同样转速和时间离心，弃上清液，留沉渣待用。

1.3.3MALDI-TOF MS分析尿沉渣 采用加样枪吸取1 μL沉淀物均匀涂抹于96孔靶板上，待干燥。再加入1 μL 70%甲酸，干燥，再加上1 μL基质液涂抹均匀，干燥后进行质谱分析。标本干燥后将靶板放入MALDI-TOF MS检测。MALDI-TOF MS收集的质量范围为2 000～20 000 Da，图谱采集使用Flex Control软件，使用Bruker Biotyper软件对检测结果与标准数据库进行对比，用分值量化和判定结果，评分≥2.0分表示可鉴定到种的水平；评分为1.7～<2.0分表示可鉴定到属的水平；评分<1.7分则表示无法给出可信的鉴定结果。

1.3.4菌落鉴定 首先采用MALDI-TOF MS进行菌落鉴定，然后使用Vitek 2 Compact、BD M50两种仪器对菌落进行复核鉴定。

1.3.516sRNA检测 尿沉渣直接通过MALDI-TOF MS分析得到的阳性结果中挑选出7株细菌提取DNA，进行16sRNA扩增，具体操作参照文献[13]。PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司测序，验证MALDI-TOF MS的准确性。

1.4统计学处理 采用Excel2007软件进行数据处理及统计学分析。

2 结 果

2.13种仪器对单一菌感染尿液标本培养菌落鉴定符合率 300份中段尿液标本中，3种仪器均检测出单一菌感染63株，其中肺炎克雷伯菌8株，大肠埃希菌40株，粪肠球菌9株，铜绿假单胞菌3株，产气肠杆菌1株，里昂葡萄球菌1株，黏质沙雷菌1株，MALDI-TOF MS菌落鉴定结果与BD M50 及Vitek 2 Compact检测结果一致，符合率为100.0%。尿液标本培养结果表明，革兰阴性菌为尿路感染主要的致病菌，大肠埃希菌最为常见(57.7%)，肺炎克雷伯菌次之(15.4%)；革兰阳性菌也占少数，以粪肠球菌为主(7.7%)。

2.2单一菌感染中MALDI-TOF MS检测尿沉渣与菌落鉴定结果的比较 MALDI-TOF MS直接检测尿沉渣共得到25份阳性结果，尿沉渣总检出率为39.7%(25/63)；其中肺炎克雷伯菌培养后采用MALDI-TOF MS进行菌落鉴定共检出菌株8株，尿沉渣检出4株，尿沉渣检出率为50.0%；大肠埃希菌培养后采用MALDI-TOF MS进行菌落鉴定共检出菌株40株，尿沉渣检出15株，尿沉渣检出率为37.5%；粪肠球菌培养后采用MALDI-TOF MS进行菌落鉴定共检出菌株9株，尿沉渣检出2株，尿沉渣检出率为22.2%；铜绿假单胞菌培养后采用MALDI-TOF MS进行菌落鉴定共检出菌株3株，尿沉渣检出1株，尿沉渣检出率为33.3%；产气肠杆菌、里昂葡萄球菌、黏质沙雷菌培养后采用MALDI-TOF MS进行菌落鉴定共检出菌株各1株，尿沉渣检出各1株，尿沉渣检出率均为100.0%。 见表1。

表1 单一菌感染的中段尿液标本菌株检出情况

2.3混合菌感染中MALDI-TOF MS尿沉渣检测与菌落鉴定结果的比较 培养结果为两种细菌感染的标本有20份，MALDI-TOF MS进行培养菌落鉴定的优势菌为粪肠球菌6株(30.0%)，大肠埃希菌5株(25.0%)，溶血葡萄球菌4株(20.0%)，无乳链球菌2株(10.0%)，屎肠球菌2株(10.0%)，铜绿假单胞菌1株(5.0%)，非优势菌主要为表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、棒状杆菌、气单胞菌、链球菌等常见污染菌，而MALDI-TOF MS直接从2份尿沉渣中检出2株屎肠球菌(优势菌>104CFU/mL)，检出率为10.0%(2/20),其他优势菌及非优势菌在尿沉渣中均未直接检出。

2.416sRNA扩增及测序结果 7株细菌扩增结果见图1，测序经过https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站BLAST比对，分别为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、里昂葡萄球菌、黏质沙雷菌，与Vitek 2 Compact及MALDI-TOF MS鉴定结果完全一致。

注：M为标记物，200～4 500 bp；泳道1～7分别为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、里昂葡萄球菌、黏质沙雷菌。图1 7株细菌16sRNA扩增结果

3 讨 论

MALDI-TOF MS以快速、准确、重复性好、高通量的特点在细菌的鉴定、耐药性和毒力监测中发挥越来越重要的作用[2]。MALDI-TOF MS还应用于其他方面的研究，例如用于流行病学的研究、基因分型、血培养报阳瓶的直接鉴定(MALDI SepsityperTM试剂盒)和其他体液或选择性肉汤培养标本的直接鉴定等。传统的细菌培养和生化鉴定方法无法对大肠埃希菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等多种血清型病原菌进行分类，而现在MALDI-TOF MS对多种血清型细菌进行鉴定和分类已得到初步应用[3]。王晔茹等[4]应用优化的MALDI-TOF MS试验条件对含有沙门氏菌的患者粪便标本进行检测和分型，并与血清学分型进行比较。对于血培养报阳的标本，MALDI-TOF MS的鉴定率较高，可用于处理混合感染的标本；KOK等[5]使用MALDI SepsityperTM试剂盒对507份血培养阳性的标本直接进行MALDI-TOF MS检测，鉴定出379份(74.8%)阳性标本，其中358份为单一菌感染，21份为混合菌感染。

目前，MALDI-TOF MS技术在临床微生物的诊断上具有优势，主要应用于细菌和真菌的菌种鉴定，但是在某些方面还是存在不足。如在检测单一菌种的标本时，MALDI-TOF MS 的检测结果可能无法达到菌落鉴定的相对分值，如菌落鉴定为大肠埃希菌的40份尿液标本中，有11份标本直接检测评分≥2.0分，4份标本评分为1.7～<2.0分，1份标本评分<1.7分，剩余14份标本无图谱，而其他尿沉渣检测不是大肠埃希菌的标本有10份。造成上述这种现象的主要原因可能包括标本中细菌的含量少，菌量不一，存在部分的干扰物质，光谱采集不准确等；而菌量较多的峰图信号好，鉴定值高，结果可靠；菌量少的峰图信号不好，鉴定准确度不高，检测结果不佳；未检出的和无法鉴定是大肠埃希菌的标本可能是因为菌量太少，也有可能是尿液标本中还存在蛋白质、混合细菌等干扰物质，导致检测结果不可靠[6-7]。也有学者提出“短期培养法”，4～6 h后采集菌膜并用MALDI-TOF MS直接检测，准确率可得到明显提高[8]。

在本研究中，中段尿液标本经培养后菌落鉴定为单一菌感染的63份标本，而MALDI-TOF MS检测尿沉渣的鉴定阳性率为39.7%(25/63)；两种细菌混合感染的标本有20份，MALDI-TOF MS鉴定的阳性率为10.0%(2/20)。从中可以看出两种细菌混合感染的阳性率远低于单一细菌感染的阳性率[9]。而WANG等[10]的研究发现尿液标本中两种细菌只有优势菌能够被检出。在本研究中，MALDI-TOF MS检测混合菌感染的中段尿液标本时，优势菌数量比非优势菌数量高一个数量级，受非优势菌干扰的概率较低。

MALDI-TOF MS直接检测尿沉渣与尿液标本培养菌落鉴定有一定的差异，可能受到以下几种因素影响[11]：(1)尿液标本直接洗涤离心，细菌和蛋白可能混在沉淀中，导致质谱峰图不佳，检出率低；(2)尿液标本没有经过培养，菌量少，从而无法得出鉴定结果；(3)MALDI-TOF MS光谱采集不准确，菌量低于检出限等。

尿路感染是人类常见的感染性疾病，95%以上的尿路感染是由单一细菌引起的，其中约90%的门诊患者和50%的住院患者感染的病原菌为大肠埃希菌，但也有少部分患者感染金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、念珠菌等。传统的尿路感染诊断依靠尿液分析、尿沉渣技术、革兰染色镜检和细菌培养等，但目前临床更偏向于使用快速准确的检测技术。有研究对尿路感染的220份尿液标本进行常见的MALDI-TOF MS直接鉴定，当菌量>105CFU/mL时，鉴定到属的检出率为92.7%，鉴定到种的检出率为91.8%，特别是对大肠埃希菌的鉴定，检出率达到97.6%，检出时间也极大缩短[12]。临床上尿液标本的培养一般需要24 h，应用MALDI-TOF MS则可以快速完成菌种的鉴定。对于混合菌感染的尿液标本，MALDI-TOF MS也可报告优势菌，节省了分纯培养的时间,为获得更好的治疗争取了时间并减少了费用。而16sRNA扩增技术的灵敏度与培养结果具有很好的一致性；并且在诊断使用过抗菌药物的患者标本中，具有更多的优越性[13]。

4 结 论

MALDI-TOF MS的推广和使用，不仅能优化检验流程，还可以节省大量的成本和时间，快速准确地鉴定病原菌，对临床细菌感染的诊断及治疗具有重大意义。