可溶性Tim-3及Galectin-9在结核性脑膜炎患者脑脊液中的表达及意义*

孙 霞，王 丽，李庭毅

(湖北省孝感市中心医院神经内科二病区，湖北孝感 432000)

结核性脑膜炎是一种中枢神经系统的传染病[1-2]。结核性脑膜炎临床表现复杂，临床诊断比较困难[3]。目前，结核性脑膜炎的诊断主要基于脑脊液分析，但灵敏度和特异度均较低，且耗时长[4]。 因此，有必要寻找灵敏度和特异度均较高的生物标志物用于快速诊断或排除结核性脑膜炎。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)特异性表达于终末分化的CD4+Th1细胞[5]。有研究证明了Tim-3在适应性免疫细胞及先天性免疫细胞上的表达，包括树突状细胞、巨噬细胞和肥大细胞[6-7]。 Tim-3的天然配体是半乳糖凝集素-9(Galectin-9)，后者是一种结合β-半乳糖苷的凝集素。Tim-3与Galectin-9的相互作用在免疫调节中起着至关重要的作用[8-9]。本研究拟探讨可溶性Tim-3、Galectin-9在结核性脑膜炎患者脑脊液中的表达及意义，为结核性脑膜炎的早期诊断及治疗提供理论及临床依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年4月至2018年9月本院收治的结核性脑膜炎患者86例为病例组，病程(9.93±5.64)年，均符合《临床诊疗指南结核病学分册》的诊断标准[10]。选择同期以头痛症状为主，但神经系统查体、脑脊液及相关辅助检查均正常的患者76例为对照组。病例组及对照组在血压、年龄、性别比例、吸烟比例、饮酒比例等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。研究对象排除标准：(1)妊娠期或近3个月有手术史、创伤史；(2)存在冠心病以外的其他心脏病、心功能不全，合并未控制的严重高血压、瓣膜性心脏病，接受过急诊冠状动脉介入治疗；(3)由于其他因素而导致的中枢或周围神经病变；(4)严重高血压、呼吸道疾病、周围血管性疾病或栓塞性疾病。 研究对象终止、退出标准：(1)患者依从性差；(2)出现严重不良事件及其他原因致使继续试验困难。所有研究对象均自愿参与本研究，并签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审核批准后进行(伦理获批号：NO2019伦审-43号)。

表1 对照组与病例组基础资料的比较

1.2仪器与试剂 MK3-3酶标仪购自美国热电仪器公司；Tim-3、Galectin-9、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-8、IL-10、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。

1.3脑脊液标本采集 所有患者均在就诊后 24 h 内接受腰椎穿刺术，获取脑脊液标本3 mL，将脑脊液标本立即以1 300×g离心10 min，并将上清液置入1.5 mL微量离心管中在—80 ℃冰箱储存。

1.4检测方法 ELISA法检测脑脊液Tim-3、Galectin-9、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平。以检测Tim-3为例，根据厂家的说明书，向每个孔中加入100 μL标本稀释剂，然后向孔中加入10 μL标准品、标本。将微量滴定板在37 ℃下孵育20～24 h。洗涤后，每孔加入100 μL的抗人Tim-3过氧化物酶缀合的单克隆抗体，在室温下温育2 h。洗涤后，向每个孔中加入色原3,3,5,5′-四甲基联苯胺。在室温下进行30 min酶反应。通过加入终止溶液(0.35 mol/L Na2SO4)终止显色底物反应，并在450 nm处读取吸光度值。使用由标准品绘制的校准曲线计算结果。

2 结 果

2.1两组间Tim-3、Galectin-9水平比较 病例组Tim-3、Galectin-9水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组间Tim-3、Galectin-9水平的比较

2.2两组间IL水平比较 病例组IL-2、IL-4、IL-8、IL-10水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组间IL-2、IL-4、IL-8、IL-10水平的比较

2.3两组间IFN-γ、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平的比较 病例组TNF-α、hs-CRP、ESAT-6均明显高于对照组，IFN-γ明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组间IFN-γ、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平的比较

2.4Tim-3、Galectin-9与各变量的相关分析 Tim-3、Galectin-9与IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6呈正相关(P<0.05)，与IFN-γ呈负相关(P<0.05)。见表5。

表5 Tim-3、Galectin-9与各变量的相关分析

2.5结核性脑膜炎患者发生死亡事件的多元Logistic回归分析 对结核性脑膜炎患者进行1年随访，发生死亡18例。以结核性脑膜炎患者是否发生死亡事件为因变量(是=1，否=0)，单因素分析有意义的因素为自变量进行多因素Logistic逐步回归分析，结果发现高水平的Tim-3、Galectin-9、ESAT-6均为结核性脑膜炎患者发生死亡事件的危险因素(P<0.05)。见表6。

表6 结核性脑膜炎患者发生死亡事件的多元Logistic回归分析

2.6Tim-3及Galectin-9诊断结核性脑膜炎的性能分析 ROC曲线分析显示，Tim-3、Galectin-9两者单独检测诊断结核性脑膜炎的ROC曲线下面积(AUC)相近，均小于Tim-3联合Galectin-9；Tim-3、Galectin-9单独检测诊断结核性脑膜炎的灵敏度、特异度相近，差异无统计学意义(χ2=1.219、1.695，P>0.05)，均小于Tim-3联合Galectin-9，差异有统计学意义(χ2=16.249、17.023，20.325、19.587，P<0.05)。 见表7、图1。

表7 Tim-3及Galectin-9诊断结核性脑膜炎的性能分析

注：A为Tim-3联合Galectin-9;B为Tim-3;C为Galectin-9;D为参考线。图1 Tim-3及Galectin-9诊断结核性脑膜炎的ROC曲线

3 讨 论

结核性脑膜炎感染仍然是一个全球性的健康问题。根据世界卫生组织的报告，全球结核性脑膜炎的发病率每年增长0.4%，特别是在发展中国家该病发病率增长更快[11]。结核分枝杆菌感染是患者发病和死亡的主要原因，延迟或不治疗会增加患者发生不可逆的神经系统后遗症和死亡的风险[12]。

Tim-3、Galectin-9是免疫细胞因子，其产生可能与结核性脑膜炎病理学的发展有关，包括组织坏死和恶病质[13-14]。在中枢神经系统中，Tim-3、Galectin-9已被证明可诱导发热反应，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，并触发其他细胞因子的释放，包括IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、hs-CRP等[15-16]。Tim-3、Galectin-9在中枢神经系统中还可能依赖于由常驻细胞群或浸润的白细胞(例如T细胞)产生的其他细胞因子的存在。由于Tim-3、Galectin-9可以从免疫细胞中主动分泌，或者从垂死细胞被动释放到细胞外空间，Tim-3、Galectin-9的释放作为一种危险信号，代表一种压力状态和对某些刺激的炎性反应。一项前瞻性研究表明，脑缺血患者血清Tim-3、Galectin-9水平升高[17]。在Tim-3、Galectin-9过表达的转基因小鼠海马中表现出明显的小胶质细胞增多，表明Tim-3、Galectin-9能诱导神经元细胞损伤[18]；用Tim-3、Galectin-9处理少突胶质细胞，这些细胞对Fas介导的细胞凋亡更敏感。Tim-3、Galectin-9可调控免疫细胞的定向转移和趋化性，并激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞上相应的趋化因子受体。在大鼠肝纤维化试验中，Tim-3、Galectin-9促进淋巴细胞、巨噬细胞凋亡，并抑制淋巴细胞、巨噬细胞从脾脏向肝脏的转移，参与炎性反应[19-20]。本研究结果显示，病例组Tim-3、Galectin-9、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平均高于对照组，IFN-γ水平低于对照组；Tim-3、Galectin-9与IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6呈正相关，与IFN-γ呈负相关。这与上述讨论符合，结合Logistic回归分析，高水平的Tim-3、Galectin-9、ESAT-6均为结核性脑膜炎患者发生死亡事件的危险因素，说明结核性脑膜炎患者脑脊液中Tim-3、Galectin-9水平升高，高水平的Tim-3、Galectin-9可能与结核性脑膜炎病情严重程度关系密切。研究表明，Tim-3、Galectin-9通过碱基互补配对与靶RNA的编码区特异性结合抑制RNA的翻译，激活淋巴细胞锚定融合血管内壁，促进免疫细胞束缚病变靶细胞，而一些细胞免疫活性因子(MCP-1、TNF-α、IL-2、IL-8)与Tim-3、Galectin-9表达呈正相关[21]，这也证实了本研究的观点。本研究同时发现Tim-3、Galectin-9两者单独检测诊断结核性脑膜炎的AUC、灵敏度、特异度相近，均小于Tim-3联合Galectin-9。这提示Tim-3、Galectin-9联合诊断结核性脑膜炎具有较高的灵敏度、特异度。

4 结 论

结核性脑膜炎患者脑脊液中Tim-3、Galectin-9水平升高，高水平的Tim-3、Galectin-9水平与结核性脑膜炎病情严重程度关系密切；Tim-3、Galectin-9联合诊断结核性脑膜炎具有较高的灵敏度、特异度，值得在临床上推广应用。