黄连素对百草枯中毒大鼠急性肺损伤的保护作用＊

陈文龙 ，舒维 ，汤旭惠 ，肖翔宇 ，傅强

（1.江西省人民医院急诊科，南昌 330006；2.江西省胸科医院中西医结合呼吸科，南昌 330006）

百草枯（PQ）是一种全球广泛应用的除草剂，误服、皮肤粘膜接触、气道吸入等都可造成急性中毒，致死剂量小，是中毒病死率最高的农药。PQ吸收入人体后，在肺内聚集，较大剂量可短时间引起急性肺损伤，呼吸衰竭，多脏器功能损伤。PQ中毒机制目前普遍认为和炎症爆发及氧化应激等相关[1]。PQ中毒治疗目前无特效对抗药和解毒剂，仍处于探索阶段[2，3]。黄连素，主要由中药黄柏、黄连提取，又称盐酸小檗碱（berberine，BBR），具有清热燥湿、泻火解毒等功效，具有抑菌作用，广泛应用于肠道感染。近些年，大量研究发现黄连素在调节血糖、血脂、控制心律失常、抑制炎症反应、抗肿瘤等具有显著效果，对心脏、肾脏、肝脏具有较强的脏器保护作用[4，5]。本研究采用黄连素干预PQ中毒大鼠，探索黄连素对PQ中毒大鼠急性肺损伤的影响及机制，以期为PQ中毒治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性SD 大鼠40只，由南昌大学医学院动物实验部提供，体重为300-400g，普通级，随机分为正常对照组 （Ctrl）、中毒模型组（PQ）、黄连素低剂量组（PQ+LBBR）、黄连素高剂量组（PQ+HBBR），共4组，每组10只。

1.2 材料 质量浓度为20%PQ浓缩液 （上海先正达有限公司），黄连素（长春新安药业有限公司公司），TNF-α、IL-1β、MDA、SOD、考马斯亮蓝检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 实验方法 PQ组、PQ+LBBR组、PQ+HBBR组大鼠，采用PQ一次性灌胃染毒法（40 mg/kg）复制PQ中毒模型[6]。PQ+LBBR组、PQ+HBBR组大鼠染毒后分别予以40 mg/kg、150 mg/kg黄连素灌胃，1次/d，连续3d[7]。Ctrl组、PQ组以相等剂量溶媒（0.5%CMC-Na）胃内灌入，1 次/d，连续 3d。

1.4 观察指标 72h后观察大鼠的一般情况，选用10%水合氯醛（4.5mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠开胸后暴露肺和心脏，取采血针穿刺入心脏，采取5ml血液，留取血浆检测TNF-α和IL-1β含量。采集血液后，充分暴露并切开气管，将灌胃针插入气管，深度约5mm，予以手术线固定，采用生理盐水灌洗，每次2ml，共2次。回收支气管-肺泡灌洗液（BALF）进行白细胞计数、测定蛋白含量。剪下整个肺脏，观察肺脏的大体情况，分离大鼠肺组织，取大鼠右肺中叶用4℃生理盐水冲洗，用滤纸将水吸干，称湿重（W），然后将肺组织置于80℃烘干48h，称干重（D），计算肺W/D比值。切取右肺后叶肺组织打浆、离心，硫代巴比妥酸（TBA）法测定匀浆内MDA含量，黄嘌呤氧化酶（羟胺）法测定肺组织匀浆内SOD活力，取左侧肺组织10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，在光学显微镜下观察各组大鼠肺组织病理变化。

1.5 统计学处理 实验结果用表示，采用统计软件SPSS19进行分析，多样本均数比较采用单因素方差分析 （one-way ANOVA），组间两两比较应用SNK-q检验，方差不齐选用Dunnett’s T3检验，以P＜0.05表示有统计差异。

2 结果

2.1 72h后大鼠一般情况 Ctrl组大鼠毛发干净、光亮、能快速活动、呼吸平稳、能正常饮食。PQ组大鼠毛发蓬松、无光泽、皮肤发绀、活动缓慢、呼吸急促、饮食减少，部分有腹泻症状。PQ+LBBR、PQ+HBBR组大鼠与PQ组相比，其中毒症状相对较轻。

2.2 大鼠血清 TNF-α、IL-1β、及肺组织匀浆MDA、SOD含量变化 与 Ctrl组比较，PQ组中TNF-α、IL-1β及MDA含量明显高于Ctrl组，SOD含量明显低于Ctrl组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）； 与 PQ 组比较，PQ+LBBR、PQ+HBBR 组中TNF-α、IL-1β及 MDA含量较PQ组明显降低，SOD含量明显增高，有显著差异 （均P＜0.05）；与PQ+LBBR 组比较，PQ+HBBR 组中 TNF-α、MDA含量较PQ+LBBR组明显降低，SOD含量明显增高，差异显著（均 P＜0.05），见表 1。

表1 大鼠血清TNF-а、IL-6、及肺组织匀浆MDA、SOD含量变化（）

表1 大鼠血清TNF-а、IL-6、及肺组织匀浆MDA、SOD含量变化（）

注：与 Ctrl组比较，# 代表 P＜0.05；与 PQ 组比较，* 代表 P＜0.05；与 PQ+LBBR 组比较，△P＜0.05

TNF-α（ng/L）45.00±4.58 104.10±9.55#93.00±6.93＊82.06±5.85＊△组别IL-1β（ng/L） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）Ctrl PQ PQ+LBBR PQ+HBBR例数10 10 10 10 153.76±7.43 189.36±9.76#177.919±8.39＊169.30±8.34＊7.10±1.04 14.96±2.03#12.13±1.56＊10.14±1.48＊△25.05±2.39 14.30±1.53#15.97±1.68＊18.32±2.14＊△

2.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、蛋白含量、肺组织W/D比值比较：PQ组中BALF白细胞总数、蛋白含量及肺组织W/D比值明显高于Ctrl组 （均 P＜0.05）；PQ+LBBR、PQ+HBBR 组中白细胞总数、蛋白含量及肺组织W/D比值均明显低于PQ组（均P＜0.05）；PQ+HBBR组中白细胞总数、蛋白含量及肺组织W/D比值均明显低于PQ+LBBR 组（均 P＜0.05），见表 2。

2.4 肺脏的大体情况 Ctrl组大鼠双肺表面粉色、无出血点、未见水肿、触之光滑、柔软；PQ组大鼠双肺表面呈不均匀暗红色、可见明显充血水肿、有点状和片状出血灶、表面粗糙；PQ+LBBR、PQ+HBBR组双肺表面可见充血肿胀、少量出血点。

表2 肺泡灌洗液中白细胞总数、中性粒细胞百分比及蛋白含量变化（）

表2 肺泡灌洗液中白细胞总数、中性粒细胞百分比及蛋白含量变化（）

注：与 Ctrl组比较，# 代表 P＜0.05；与 PQ 组比较，* 代表 P＜0.05；与PQ+LBBR 组比较，△P＜0.05

组别 例数 BALF WBC（×106）Protein content(mg/L) 肺组织W/D 3.28±0.39 6.57±0.66#5.65±0.58#＊5.01±0.67#＊△Ctrl PQ PQ+LBBR PQ+HBBR 10 10 10 10 87.88±7.45 166.84±13.50#151.86±12.85#＊135.59±9.79#＊△103.97±10.00 219.34±14.36#198.00±15.15#＊178.00±14.49#＊△

2.5 肺组织病理及病理图 Ctrl肺组织形态结构正常；PQ组肺泡水肿充血、肺泡间质增厚、肺泡间隙聚集大量炎症细胞、毛细血管充血；PQ+LBBR、PQ+HBBR组肺组织损伤较PQ组减轻，见图1-4。

肺组织病理图

图1 Ctrl组HE*200

图2 PQ组 HE*200

图3 PQ+LBBR组HE*200

图4 PQ+HBBR组 HE*200

3 讨论

PQ通过皮肤、黏膜、胃肠道和呼吸道等部位吸收，引起急性肺损伤，呼吸衰竭，PQ中毒机制尚未明确[1]。大量研究证实，氧化应激是PQ中毒急性肺损伤的主要机制之一。PQ进入肺组织后，经NADPH还原作用等生成大量百草枯单阳离子自由基（PQ+）、超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基等氧自由基。氧自由基通过损伤线粒体膜、脂质过氧化损伤细胞膜，破坏细胞功能结构，导致细胞凋亡[8，9]。本研究发现黄连素能降低PQ中毒大鼠肺组织匀浆MDA含量，提高肺组织匀浆SOD含量，且较大剂量作用更强，这表明黄连素能抑制PQ中毒肺组织氧化应激，且可能呈剂量依赖性。

炎症爆发也是PQ中毒急性肺损伤的主要机制，PQ在肺组织中聚集后刺激巨噬细胞和上皮细胞释放大量炎症因子如TNF-α、IL-1β和干扰素（IFN-γ）等，引发炎症反应，导致中性粒细胞和单核巨噬细胞等炎性细胞聚集，血管通透性增加，引起急性肺损伤[10]。此外，氧化应激与炎症反应是相互影响和促进的[11]。Park，MH等[12]研究发现TNF-α、IL-1β是炎症表达过程中的重要因子。本研究发现黄连素能降低PQ中毒大鼠血清TNF-α、IL-1β含量，较大剂量作用更明显，这表明黄连素能抑制PQ中毒急性肺损伤的炎症反应，且可能呈剂量依赖性。

黄连素为传统中药黄连、黄柏等的提取物，作为抑菌剂在临床中广泛应用，且价格低廉，不良反应少。近些年黄连素在抗氧化应激、炎症反应等方面进行了广泛研究。马竞等[7]研究LPS诱导的脑损伤大鼠发现黄连素通过抑制LPS诱导的细胞凋亡、氧化应激、炎症和NF-细胞的激活，而对大鼠脑损伤发挥保护作用。Wang，Y等[13]体外细胞实验发现黄连素通过抑制NF-细胞和IL-6介导的STAT3激活，在脂多糖诱导的脓毒症中充当负调节剂。Jin，JL等[14]实验证实黄连素可改善脓毒症大鼠的心肌损伤和心脏功能，其机制可能与抑制LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路的激活并进一步减少TNF-α和IL-1β的产生有关。Li，Z等[15]研究发现BBR通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制PC-12细胞中的氧化应激和线粒体功能障碍，从而保护叔丁基氢过氧化物（t-BHP）诱导的细胞毒性。Kazaz，I O等[16]动物实验发现黄连素通过降低氧化应激抑制缺血再灌注引起的大鼠睾丸损伤。本研究采用黄连素干预PQ中毒大鼠，通过观察72h后大鼠的一般情况，肺泡灌洗液的白细胞计数和蛋白，肺组织匀浆MDA、SOD含量，血浆TNF-浆和IL-1浆含量，肺组织干湿比值，肺组织病理等指标并与对照组比较。证实黄连素能减轻PQ中毒大鼠氧化应激及炎症反应，对急性肺损伤具有保护作用。

综上所述，黄连素能减轻PQ中毒大鼠的炎症反应及过氧化损伤，对PQ中毒大鼠急性肺损伤具有保护作用，较大剂量组效果更明显。这为黄连素在新的领域应用提供了一定的研究基础，也为寻找PQ中毒新的治疗方法，改善中毒治疗效果提供了理论依据。