SMTN基因多态性rs2074738与慢性阻塞性肺疾病急性加重的相关性研究＊

王蔚，杨青，况九龙，叶小群

（南昌大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，南昌 330006）

平滑肌特异性蛋白(smoothelin)是一种特殊类型的细胞骨架蛋白，表达于终末分化的、收缩的平滑肌细胞。目前研究表明其基因SMTN的表达减少与平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)从收缩到增殖的表型调节有关，可作为SMC表型转换的标记物[1]，但其与慢性阻塞性疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)之间的关系尚不清楚。研究者通过前瞻性临床观察队列研究，收集268例不同严重程度COPD患者的SMTN基因多态分析资料与临床特征，探讨人类SMTN基因单核苷酸多态性与COPD患者的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2017年1月至2017年8月在我院呼吸科住院治疗的COPD患者共268例，其中男202 例，女 66 例；平均年龄（71.7±8.9）岁，男（71.2±9.2）岁，女（73.3±7.8）岁。 后对所有患者进行一年随访，期间有94例患者再发急性加重;其中大多数(n＝74，78.72%)在一年的随访中经历过一次急性加重事件，其他患者至少出现过两次或以上的急性加重事件(n＝20，21.28%)，这其中包括 14 例死亡患者(14.89%)。疾病诊断标准符合全球阻塞性肺病肺活量测定标准。一般吸烟者定义为每天吸烟≥1支，累计超过6个月。吸烟指数(smoking index，SI)＝每天吸烟数×吸烟年数。入组时提取社会人口信息、实验室检验、肺功能及心脏超声检查。排除标准：合并有哮喘、支气管扩张、左心室功能障碍、特发性肺动脉高压、高血压、糖尿病、动脉粥样硬化相关疾病和其他周围血管疾病。所有患者在随访期间接受适当的药物、和/或长期氧疗、无创通气支持治疗[2]。

这项研究得到医院伦理委员会的批准；每个患者在入组前都签署了知情同意。

1.2 方法 在国家生物技术信息中心SNP数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)中，共有301个人类SMTN基因的单核苷酸多态性。课题组还筛选了国际hapmap项目网站(www.hapmap.nc)上列出的标签SNP的数据；同时还参考了之前在NCBI、Celera Discovery SystemTM(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）注册的SNP等位基因频率信息和国际单倍型图项目。在这些基因信息数据库中发现有5个单核苷酸多态性在作为遗传关联实验的标记物时，小等位基因频率(maf)大于0.15。基于以上研究背景，本课题组筛选了5个单核苷酸多态性(rs2074738，rs5997872，rs56095120，rs9621187 和rs10304)作为研究对象。其中，rs5997872为外显子，rs10304位于3’非翻译区(UTR)，其余三个 SNP为内含子。从患者外周血中提取DNA后，采用PCR-连接酶检测反应法进行基因分型。利用引物对五个目标单核苷酸多态性(SNP)进行PCR扩增。PCR产物使用ABI3730XL DNA测序仪进行分析，并对具有代表性的产物进行直接DNA测序以证实准确性。

1.3 统计学分析 所有变量均以均值±SD表示。采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，P＜0.05（双侧）提示呈现显著差异。使用卡方检验分析分类变量的差异、对对照组进行Hardy-Weinberg平衡(HWE)分析、评价基因型分布和等位基因频率。采用无条件Logistic回归模型估计基因型特异性风险的概率比(OR)和95%置信区间(CI)。

2 结果

2.1 COPD患者临床特征分析 急性加重组与稳定组之间身体质量指数 (body mass index，BMI)(19.15±2.83vs20.35±2.74，kg/m2，P＝0.0184)（图 1）、血清肌酐 (serum creatinine，Scr)(83.52±27.57vs73.14±23.52，umol/l，P＝0.0309)（图 2）、 及肺功能一秒率（第一秒用力呼气容积/预计值，forced expiratory volume in one second/prediction，FEV1%） (35.27±15.04vs42.03±17.66，P＝0.0280)（图 3） 有显著性差异。吸烟状况、年龄、收缩压 (SBP)、B型脑钠肽(BNP)、谷草转氨酶(AST)、空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、动脉血氧分压(PaO2)及心脏超声结果（如右房左右径、右室内径、肺动脉内径、三尖瓣返流速度），在两组间无显著差异（部分数据见表1）。

表1 患者临床特征

2.2 SMTN基因多态性等位基因频率 在急性加重组与稳定组中，rs2074738基因型分布在总体人群(P＝0.037)和在男性中(P＝0.013)的显性模型分布有显著差异。在急性加重组中，rs2074738的GG基因型明显显示出更高的频率。这些模型的显性和隐性由它们在受试者中的频率来定义（见表2）。

2.3 SMTN基因多态性rs2074738与COPD再发急性加重的相关性 使用下列变量进行Logistic回归：SBP、Scr、FBG、TC、年龄、PaO2和吸烟状况。 与急性加重相关的rs2074738的GG基因型在总体人群(OR＝2.613，95%CI＝1.059-6.444，P＝0.037)、特别是男性患者 (OR＝4.091，95%CI＝1.358-12.318，P＝0.0123)之间有显著性差异。同时在男性中观察到其他环境因素：FBG(OR＝1.34，95%CI＝1.053-1.704，P＝0.0173)和年龄(OR＝1.067，95%CI＝1.008-1.130，P＝0.0257)对急性加重有影响（见表 3）。

3 讨论

在随访1年的研究中，研究者评估了SMTN基因多态性与COPD急性加重的关系。在基线临床特征上，BMI是COPD急性加重的一个预警指标[3]。FEV1%是反映COPD患者肺功能最重要的指标，它的数值下降可对急诊急性加重患者的救治效果产生显著影响[4]。本研究对基线特征的分析也发现，反复急性加重组患者的基线BMI值、Scr和FEV1%均明显低于稳定组；提示低体重、低血清肌酐和低一秒率水平，和COPD反复急性加重明显相关。同时研究发现在其他临床特征大致相同的情况下，反复发作患者的SMTN基因单核苷酸rs2074738的基因型和等位基因频率的总体分布有显著差异；而且在吸烟状况、PaO2、血压等外在环境因素无差异的情况下，SMTN基因单核苷酸rs2074738的GG基因型与COPD急性加重成正相关，可作为急性加重事件的独立的预测标记物。在携带GG基因型的个体中，急性加重的风险高出2.613倍；尤其在男性患者中，该风险高出4倍。此外，研究者还发现一些环境因素可以影响COPD的恶化。空腹血糖升高和年龄增加可能增加COPD再发急性加重的风险，这与临床过程一致。

表2 急性加重组与稳定组的基因型及等位基因分布

表3 急性加重组GG基因型rs2074738混杂因素的Logistic回归分析

基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性、以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示在不同个体间生物活性物质的功能及效应存在差异。真实世界研究提示COPD人群易感性与不同基因的基因多态性之间存在某种联系，如曾有研究提示去整合素基质金属蛋白酶19 rs1422795位点基因多态性与CO PD无明显相关性，可能不是COPD的易感基因[5]。尽管如此，对于COPD肺血管SMC损伤、及其表型改变的研究未曾涉及。COPD患者肺内出现低氧血症可引起中膜血管SMC和外膜成纤维细胞过度增殖、以及细胞外基质蛋白沉积而导致持续的血管收缩，从而诱导血管重构[6]。血管SMC在包括缺氧等各种病理或生化的刺激下，可以可逆地从终末分化的、收缩表型转换为增殖的、迁移的合成表型，调节呼吸系统的血管张力和功能[7-9]。而终末分化（即收缩功能）的SMC中存在SMTN基因的特异性表达；未分化的（即增殖的）SMC中该基因则很少表达。动物研究发现SMTN基因敲除的小鼠寿命较短，肠平滑肌收缩减少，胃肠蠕动受损[10]。早期冠状动脉粥样硬化的冠脉中层细胞增殖伴随SMTN低表达[11]。在体研究发现SMTN基因可预测高血压、脑血管疾病的血管重构过程[12，13]。其他国外研究提示SMTN基因型可作为疾病发生的易感标记物，其基因中具有保护作用的G-C-A-C单倍型可能是原发性高血压的遗传标记[14]；C-T-T-A单倍型可能是日本男性患者发生急性脑梗塞的易感标记物，而C-A-T-G单倍型可能是保护性标记[15]。这些结果表明SMTN基因可能通过血管构型的改变参与了多种疾病的发生过程，本研究则发现其可作为COPD急性加重患者、尤其是男性患者频繁发作的易感因素。

总之，虽然COPD急性加重是一个复杂、多因素作用的结果，我们的研究表明血管构型改变参与了急性加重的过程，SMTN基因作为血管表型转换的标记物，其单核苷酸rs2074738与COPD急性加重之间有很强的相关性；rs2074738 GG基因型可能是老年男性COPD频繁发生急性加重事件的标记物。本研究为对进一步了解COPD急性加重的病理机制提供一种新的思路，同时也为以后对涉及血管相关通路的靶向治疗提供参考。

本课题存在一定局限性。在本研究人群中，男性患者占75.4%，尽管有研究证实男性是因频繁急性加重而反复就诊的显著预测因子[15]，但少样本量的研究对论证SMTN的rs2074738 GG型在全体人群中的预测作用的证据尚不充分。为了确认本研究的可靠性，需要更多的人口调查数据。

致谢：江西省卫生厅（20175289），国家自然科学基金 (81860011,COPD血清外泌体小RNA分子标志物的筛选及其在上皮-间质转化中的作用及机制研究）支持这项研究。

利益冲突：无