腺病毒介导人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮细胞的表达及蛋白活性分析

李 媛，华荣茂，段家昕，陈华丽，徐德军，杨 丽，程建勇，李晓亚，耿果霞，李青旺*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

人卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)是由下丘脑控制的垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的糖蛋白类促性腺激素，它是一种由FSHα亚基与FSHβ亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白[1]。其中FSHα亚基基因编码了92个氨基酸，包含10个半胱氨酸，形成5个二硫键；FSHβ亚基基因编码了111个氨基酸，其中包含12个半胱氨酸，形成6个二硫键[2]。FSH在人体中发挥重要的作用，在女性体内主要促进子宫内膜的生长、卵泡的发育和排卵等[3]，在男性体内可以刺激次级精母细胞的发育以及精子的产生，通过与 LH 及雄激素发挥协同作用促进精子的成熟[4]。

FSH在临床上主要用于辅助生殖方面超数排卵等功能。目前市场对于FSH产品的需求巨大，市面上主要有两种FSH产品，一种是尿源的FSH，另一种是国外进口的基因工程重组FSH(rhFSH)蛋白，国内临床应用上进口rhFSH占据主要市场。rhFSH相比尿源FSH有纯度高、生物活性高、来源均一的特点，且无LH及其他杂蛋白的污染[5]，但是国外进口的rhFSH主要是细胞表达的基因工程产品，受制于细胞表达量低的缺点，生产成本较高，因此进口rhFSH价格较为昂贵。目前动物乳腺制备蛋白药物是药物制备的热门研究领域，动物乳腺制备重组蛋白药物具备产量高、价格低的优势[6]。但是动物乳腺制备FSH的研究还停留在鼠和兔等小动物层面[7-8]，未见大动物制备FSH相关研究报导。本研究旨在构建重组人FSH基因腺病毒表达载体，利用羊乳腺上皮细胞(GMEC)表达人FSH重组蛋白，并验证其体外生物学活性，为大动物乳腺制备人FSH奠定前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 pAdTrack-CMV、pAdEasy-1购自优宝生物；pIRES-FSH-neo3表达载体、pIRES-FSHR-puro3表达载体、HEK293A细胞、HEK293T-FSHR细胞、GMEC细胞、大肠杆菌DH5α、BJ5183菌株由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 T4连接酶、限制性内切酶购自New England Biolabs公司；质粒小提试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基购自Hyclone公司；蛋白质 Marker (MP102)、D2000 DNA Marker、D15000 DNA Marker购自天根生化科技有限公司、SDS Page凝胶试剂盒、ECL超敏化学发光试剂盒、胎牛血清购自碧云天；His tag标签蛋白纯化试剂盒购自康为世纪；Lipofectamine 2000 脂质体购自Invitrogen公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)购自Sigma公司；Anti-FSH兔多克隆抗体购自Abcam公司；cAMP检测试剂盒购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒载体的构建及鉴定 重组腺病毒穿梭载体的构建是基于实验室前期已经构建好的pIRES-FSH-neo3表达载体的基础上亚克隆得到的。根据GenBank中人FSH的序列(NP_000726.1，NP_000501.1)，以pIRES-FSH-neo3载体为模板，设计上游引物F：AGATCTATGGACTACTACAGGAAGT(BglII)，下游引物R： AAGCTTCTAATGATGGTGGTGATGGTGAC(HindIII)，经过PCR扩增后，产物用DNA琼脂糖凝胶检测，切胶回收目的基因片段。将目的基因片段和穿梭载体pAdTrack-CMV用BglII和HindIII限制性内切酶双酶切，通过T4连接酶连接得到pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭载体。用BglII和HindIII双酶切验证以及测序验证穿梭载体的正确性。用PmeI酶将pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭载体线性化，切胶回收载体，将其转化到含有pAdEasy-1骨架载体的BJ5183感受态，在含卡那霉素的LB平板上过夜生长。挑取平板上较小的菌落，扩大培养后，提取质粒，并用PacI酶切验证目的基因是否与骨架载体重组得到腺病毒载体pAdEasy-FSH/His，同时测序验证重组腺病毒载体的正确性。

1.2.2 重组腺病毒的包装、扩增与滴度测定 将HEK 293A细胞复苏后传代到25 cm2的细胞培养瓶中，确保24 h后细胞汇合度为50%左右，将已经测序正确的线性化腺病毒表达载体pAdEasy-FSH/His和脂质体Lipofectamine 2000按照1:3(3 μg质粒：9 μL脂质体)的比例转染HEK 293A，转染4～6 h后更换新鲜培养基。转染3 d后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达，每2～3 d添加少量新鲜培养基。到10～14 d后，细胞几乎全部可以观察到荧光，并且细胞呈葡萄球状且大量漂起，此时可收集第一代病毒。用第一代病毒感染HEK 293A细胞，扩增后收集第二代病毒，如此反复，收集得到第三代腺病毒，用LaSRT法测定第三代腺病毒滴度。

1.2.3 重组人FSH腺病毒感染GMEC细胞 感染前确定腺病毒感染的最佳MOI值，将实验室冻存的GMEC细胞复苏，在DMEM/F12培养基(含10%FBS)、37 ℃和5% CO2下经过传代培养后，按1×105个接种于6孔板中，培养24 h后，分别用MOI值为60、100、140、180、220、260的重组腺病毒感染乳腺上皮细胞，每个组设置3个重复，2 h后换新鲜的培养液，培养48 h后观察GFP荧光情况和细胞病变状况，选择转染效率高且病变作用小的作为最佳感染复数。用最佳感染复数感染GMEC细胞48 h后，收集活细胞蛋白。

1.2.4 Western blot鉴定rhFSH在GMEC的表达 制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，进行SDS-PAGE(蛋白样品15 μL，非还原上样缓冲液，浓缩胶80 V，分离胶100 V)；将蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，4 ℃下用5%的脱脂奶粉过夜封闭；将PVDF膜置于TBST缓冲液配置的抗FSH多克隆抗体中，4 ℃过夜孵育；TBST洗膜4次，每次10 min；用羊抗兔HRP酶标二抗在4 ℃下孵育4 h；TBST洗膜4次，每次10 min；用ECL化学发光液显色后在化学发光成像仪中曝光，观察目的蛋白的表达情况。

1.2.5 rhFSH重组蛋白的纯化 将含金属Ni的琼脂糖填料混匀后装入层析柱，排出柱中乙醇，用10倍柱体积的上样缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L 咪唑，0.5 mmol/L NaCl)平衡镍柱。样品过柱完成后，用洗杂缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl)冲洗去部分杂蛋白。用适量洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl)将镍柱上的目的蛋白洗脱下来并进行SDS-PAGE鉴定。

1.2.6 体外验证rhFSH的生物学功能 将实验室建立并且保存的人卵泡刺激素受体(FSHR)基因的稳定细胞株HEK-293-FSHR进行复苏，按照2×104个细胞/孔的密度种到96孔细胞培养板，每孔加入0.1 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，培养24 h。将纯化的rhFSH蛋白作为试验组、Gonal-F作为阳性对照组，分别用培养基稀释后加入到细胞中，空白组细胞只加等体积的完全培养基，每个组设3个复孔，培养1h，裂解细胞后用cAMP试剂盒检测细胞cAMP的含量。

2 结果与分析

2.1 重组人FSH腺病毒载体的构建与鉴定

以pIRES-FSH-neo3为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶检测结果见图1A 。扩增片段约820 bp，大小与人FSH一致。回收目的基因片段，经过BglⅡ和HindⅢ双酶切后与pAdTrack-CMV连接，产物经酶切及琼脂糖凝胶电泳，获得了约9 100 bp的穿梭载体及约820 bp的目的基因条带(图1B)，穿梭载体pAdTrack-CMV-FSH/His构建成功。将pAdTrack-CMV-FSH/His用PmeⅠ酶切后转化含pAdEasy-1骨架载体的BJ5183大肠杆菌感受态，挑取4个单克隆菌落，扩大培养后提取质粒，发现有2个菌落中提取的质粒与穿梭载体条带不同，可能是重组后的腺病毒载体。以这2个质粒为模板进一步用PCR检测发现2个质粒中都可以获得大小约820 bp的目的基因条带(图2)，说明成功构建了pAdEasy-FSH/His腺病毒表达载体。

2.2 重组人FSH腺病毒的包装、扩增及滴度测定

将重组腺病毒载体用PacI酶线性化后用Lipofectamine 2000转染到HEK 293A细胞中，3 d后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达，6 d后绿色荧光表达量明显增加，9 d后细胞出现大量彗星状绿色荧光，13 d时有50%细胞从培养瓶底脱落，细胞成葡萄球形状，此时可以收集P1代病毒，细胞感染腺病毒效果如图3所示。用第一代病毒继续感染HEK 293A细胞得到第二代和第三代腺病毒，第三代腺病毒具有较高的病毒滴度，可以用来感染GMEC细胞细胞。用LaSRT法测定测定第三代病毒滴度，如图4所示，随着孔数的增加，绿色荧光逐渐变暗，即随着病毒浓度的降低，荧光逐渐减少。重组腺病毒在第8个孔时，绿色荧光数不足5个，并且在第9个孔后完全黑暗，因此计算病毒滴度为1×109PFU/mL。

2.3 重组人FSH腺病毒感染GMEC细胞及其表达rhFSH的鉴定

用得到的第三代腺病毒感染GMEC细胞，经过观察GFP荧光表达量以及细胞的病变程度发现，当重组人FSH腺病毒感染复数为180时，细胞未出现明显病变且绿色荧光表达量较多，效果最好，满足后续试验要求。用最佳感染复数感染GMEC细胞48 h后，明显能够观察到绿色荧光蛋白的大量表达(图5)。收集经过腺病毒感染与未被腺病毒感染的活细胞蛋白，通过Western blotting鉴定后，发现经过重组FSH腺病毒感染的GMEC细胞蛋白在大约40 kDa大小的地方有明显条带出现，未经过腺病毒感染的GMEC细胞蛋白在同样的位置未见条带出现，结果表明人FSH目的基因成功在GMEC细胞中表达(图6)。

2.4 rhFSH重组蛋白的纯化

用镍柱纯化GMEC细胞表达的重组蛋白，经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，结果见图7，得到大小在40 kDa左右的蛋白条带，与2.3结果中目的蛋白大小结果一致，表明用镍柱成功纯化得到了rhFSH蛋白，为下一步鉴定蛋白体外生物活性奠定基础。

2.5 体外验证rhFSH的生物学功能cAMP

FSH受体(FSHR)是G蛋白偶联受体(GPCR)，FSH激活FSHR后，FSHR诱导细胞合成cAMP。在细胞培养基中添加了GMEC细胞表达的rhFSH及阳性对照Gonal-F后，若FSH具备活性，稳定表达FSHR的HEK 293A细胞内会产生cAMP，通过裂解细胞，用cAMP检测试剂盒检测细胞裂解液中的含量可以表明FSH的生物学功能。图8中结果表明，培养基中添加了GMEC细胞表达的rhFSH和阳性对照Gonal-F两个组诱导HEK 293-FSHR细胞产生的cAMP与空白对照组比差异极显著(P<0.01)，这说明GMEC细胞表达的rhFSH具备和商品化的基因工程产品Gonal-F一样的体外生物活性。

3 讨 论

人卵泡刺激素是由脑垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，它是由FSHα亚基蛋白以及FSHβ亚基蛋白通过非共价键结合组成的异源二聚体糖蛋白[9-11]。目前FSH在临床上主要用于辅助生殖，治疗不孕不育，市场潜力巨大[12-13]。卵泡刺激素有脑垂体来源FSH、尿源FSH以及基因重组FSH。脑垂体FSH由于脑垂体来源少、不易获得，价格昂贵，所能提取到的FSH纯度不高以及其他的一些毒副作用等缺点，使得垂体FSH无法被市场广泛应用而退出市场[14]。而尿源FSH是从绝经期妇女的尿液里面提取的，早期工艺比较落后时，尿源FSH里面含的大量促黄体素(LH)及其他的杂蛋白会给治疗效果带来很大影响。基因重组FSH有着纯度高、安全性高、活性高和来源均一等优势[15]。由于FSH的糖基化过程对于其生物活性有非常重要的作用，因此需要通过真核表达系统表达重组FSH[16]。目前已经报导的用于基因工程制备重组FSH的表达系统主要有中国仓鼠卵巢细胞、巴斯德毕赤酵母表达系统、昆虫细胞等表达系统[17-19]。本研究利用哺乳动物细胞GMEC表达rhFSH蛋白，GMEC细胞和中国仓鼠卵巢细胞、巴斯德毕赤酵母表达系统、昆虫细胞等表达系统一样具备糖基化功能，经过体外活性试验验证GMEC表达的rhFSH和目前上市的Gonal-F一样具备良好的体外生物活性。

GMEC细胞与中国仓鼠卵巢细胞等不同，较难转染，因此选择一种高效的转染体系对于在GMEC细胞表达rhFSH尤为重要。腺病毒表达体系具有宿主范围广、致病性低、表达效率高、不受细胞是否分裂的影响、操作简便且病毒滴度高等优点[20]。并且目前还没有以腺病毒感染动物乳腺细胞制备FSH的研究报导。本研究采用了腺病毒转染GMEC细胞来获取rhFSH蛋白，通过构建重组人FSH腺病毒载体在HEK-293A细胞中包装得到重组人FSH腺病毒，重组人FSH腺病毒感染GMEC细胞后在细胞培养上清以及细胞质中获取了大量可溶的rhFSH，这为下一步获取纯度较高的rhFSH用于体外活性检测奠定基础，这也表明了GMEC细胞具备良好的分泌外源rhFSH蛋白的潜力。

相比细胞工程制备重组蛋白药物，如今利用乳腺生物反应器制备重组蛋白药物是较为热门的研究方向，这种方法和细胞工程方法制备FSH相比具有产量高、价格低的优势，不过目前相关方面的研究报道较少，只有少数在小鼠和兔子这类小动物乳腺中制备得到具备生物活性的重组FSH的研究报导[8,21]，这说明通过大动物乳腺制备重组FSH是可行的。为了探索将来进一步利用大动物生产人FSH蛋白药物，本研究选择山羊乳腺组织行使泌乳功能的GMEC细胞作为表达rhFSH的系统，构建了腺病毒表达载体包装得到重组人FSH腺病毒，在体外感染GMEC细胞后制备了大量的rhFSH蛋白，并验证了rhFSH蛋白具备体外生物活性，在体外细胞层面验证了大动物乳腺制备rhFSH的可行性，这为大动物乳腺制备rhFSH奠定了良好的研究基础。

4 结 论

本研究通过构建人FSH基因腺病毒表达载体，利用羊乳腺上皮细胞(GMEC)表达人FSH基因，经过Western blotting检测GMEC细胞可以成功表达rhFSH蛋白。GMEC细胞表达的rhFSH经过纯化后通过体外生物活性验证后发现其具备Gonal-F同样的体外生物功能，这为大动物乳腺制备人FSH奠定了前期的研究基础。