17β-羟基类固醇脱氢酶3基因插入/缺失与公猪睾丸表型性状关联研究

闫海龙，高 晔，刘 暖，王 珂，户会娜，陈明月，吕晓燕，潘传英*

(1.山西大同大学 医学院， 山西 大同 037000；2.西北农林科技大学 动物科技学院， 陕西 杨陵 712100； 3. 安康秦阳晨国家原种猪养殖场， 陕西 安康 725000)

猪作为保障居民肉类供给最重要的家畜，其繁殖性能直接影响经济效益。相比传统的育种手段，分子育种技术具有更方便高效的优点。猪的繁殖改良，尤其是提升种公猪的繁殖力是当前生猪产业繁育的重点任务，也是生猪育种研究的热点[1]。利用分子育种技术挖掘并解析调控猪繁殖性能的关键候选基因及遗传效应具有重要意义。

睾酮(testosterone, T)又称睾丸素、睾丸酮、睾甾酮,是最主要的雄激素，而雄性睾酮有95%以上在睾丸间质细胞(Leydig cells，LCs)线粒体内合成[2-3]，其具有促进生殖器官的发育和生长,促进并维持男性第二性征的发育,维持前列腺和精囊功能、维持精子发生等[4-5]作用。 LCs利用胆固醇或醋酸酯在线粒体、光滑内质网和微粒体中通过复杂的生物过程合成睾酮[6-7]。睾酮合成过程包括以下步骤,动员脂质滴和/或质膜中的胆固醇，将胆固醇转运至线粒体，在线粒体中形成孕烯醇酮，随后将孕烯醇酮转化为雄烯二酮，然后由平滑内质网上的还原酶将睾酮转化为二氢睾酮[8]。17β-羟基类固醇脱氢酶3(Hsd17b3)基因可在光滑内质网中催化雄烯二酮转化为睾酮[1,9]，已有研究表明，Hsd17b3基因突变会导致睾酮合成不足，从而损害雄性性腺发育[10]。Chen等首次发现Hsd17b3基因与猪的繁殖性状有显著的相关性，可作为提高猪繁殖能力育种选择的潜在DNA标记[11]。

因此，本研究旨在探究Hsd17b3基因内的插入/缺失(indel)位点与公猪睾丸表型的相关性，分析该基因多态位点与公猪繁殖的遗传关联，为了解Hsd17b3基因遗传变异与公猪繁殖性状之间的关系提供指导，也为动物育种和繁殖的改进提供生物学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物DNA样本及相关数据收集

本研究睾丸样品均采自安康秦阳晨国家原种猪养殖场，大白猪(记为DB)和长白猪(记为CB)2个品种共442头，其中大白猪333头(15日龄250头，35日龄21头，40日龄62头)；长白猪109头(15日龄10头，40日龄99头)。试验动物均健康且处于相同的饲养及管理环境。睾丸重量(Testicular weight, TW)、睾丸长周长(Testicular long circumference，TLC)和睾丸短周长(Testicular short circumference, TSC)[12]由专业人员在相同的标准下进行测量，并进一步用于关联分析。

1.2 基因组DNA的分离和DNA库的构建

通过标准盐-氯仿提取法从睾丸组织中分离出所有基因组DNA样本。将提取的DNA样品稀释至20 ng/μL作为工作溶液。随机抽取30份DNA样本构建基因组DNA库，探索Hsd17b3基因的遗传变异。

1.3 引物设计和PCR扩增

根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)中所列14个猪Hsd17b3基因的潜在多态位点 (图1)，结合课题组已完成的位点检测[12]，针对第2、4内含子区内存在的多态性位点，设计引物序列(GenBank NC_010452.4：L3-up：5'-AATCAGCAGGACCCAACG-3'，L3-down：5'-GGCCCTTCCCAGAAACCT-3'；L11-up：5'-TTTGCTGTTGGGCACGTCT-3'，L11-down：5'-CTTACCCATTCCTCGCCCTG-3')由生工(中国上海)合成。PCR反应体系包含0.5 μL(20 ng/μL)基因组DNA，正反引物各0.5 μL，6.0 μL 2×Taq Master Mix，5.0 μL ddH2O。使用Touchdown PCR程序完成扩增[12]，使用3.5%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

1.4 数据分析

计算基因型、等位基因频率和群体参数，包括基因杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态性信息含量(PIC)[13]。利用IBM SPSS 23.0软件计算indel多态性与3个生殖性状(TW、TLC和TSC)的相关性。建立线性模型分析indel位点基因型和表型之间的关系:Yijk=μ+Ai+Gj+eijk, 其中Yijk为生殖性状的观察值，μ为每个性状的总体平均值，Ai为年龄的固定效应，Gj代表基因型的固定效应，eijk为随机误差[14]。当基因型效应是性状变异的主要因素时，每种基因型的性状指标的最小二乘均方(LSM)之间的差异的P值小于0.05。

2 结 果

2.1 基因多态位点的鉴定

为检测猪多态位点的遗传变异，使用特异性引物L3、L11在30个样本的DNA池中进行扩增。电泳和比对分析结果表明，猪Hsd17b3基因存在10 bp和11 bp的插入/缺失(图2和3)。L3位点电泳显示有3种基因型,其中II基因型表现出1个条带(202 bp),ID基因型表现出2个条带(202 bp和192 bp)，DD基因型表现出1个条带(192 bp)。L11位点电泳显示有2种基因型,其中ID基因型表现出2个条带(207 bp和196 bp)，DD基因型表现出1个条带(196 bp)。PCR产物测序结果证实猪Hsd17b3基因中共有该2个indel位点的存在，描述为 NC_010452.4:g.25826684_25826685ins ATTTTTACCT,rs786286128；NC_010452.4:g.25850000_258 50010delCTTTTTGTTTT,rs789346666。

2.2 遗传参数分析

当前基因座的基因纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和基因型PIC，各品种日龄的基因型频率如表1所示。L3位点属于中度多态(0.25

2.3 猪Hsd17b3 indel位点与繁殖性状的关系

大白猪与L3、L11位点关联分析结果如表2所示。仅L11-11-bp的indel位点与15日龄大白猪的睾丸重显著相关(P<0.05)。长白猪与L3、L11位点关联分析结果如表3所示。L3-10-bp的indel位点与40日龄长白猪的睾丸长轴长、睾丸短轴长、睾丸重均显著相关(P<0.01)。

表1 大白猪和长白猪2个indel位点的基因型、等位基因频率和遗传多样性参数Table 1 The genotypes, allele frequencies and genetic diversity parameters of two indel loci in Large White and Landrace pigs

表2 大白猪2个indel位点与睾丸形态特征的相关性分析Table 2 Correlation analysis between two indel loci and morphological characteristics of testis in large white pigs

表3 长白猪2个indel位点与睾丸形态特征的相关性分析Table 3 Correlation analysis between two indel loci and testicular morphological characteristics of Landrace pigs

3 讨 论

标记辅助选择技术作为高效育种的手段，在家畜育种领域内已广泛应用，如GDF9基因多态位点在山羊产羔数上的选育应用[15]及PRNP基因多态位点对牛生长性状的选育应用[16]。生猪产业作为国民经济的支柱，研究影响猪繁殖性状的相关基因，寻找可应用于标记辅助选择的多态性位点是很有必要的。公猪选育是猪群育种体系中十分重要的环节，一头优秀的种公猪提供的精液对整个规模化猪场来说是至关重要的[17]。2019年，Chen等[11]首次从分子层面阐述了影响猪Hsd17b3基因表达和繁殖性状的潜在因素，简明准确地概述了Hsd17b3基因在公猪繁殖中的作用。因此，本研究从猪睾丸表型入手，研究Hsd17b3基因多态位点与猪睾丸表型的相关性，致力于了解Hsd17b3基因遗传变异与公猪繁殖性状之间的关系，为猪育种和繁殖的改进提供生物学理论依据。

本研究收集了15日龄和40日龄的商业公猪样本进行关联分析，结果表明L11-11-bp的indel位点与15日龄大白猪的睾丸重显著相关。L3-10-bp的indel位点与40日龄长白猪的睾丸长轴长、睾丸短轴长、睾丸重均显著相关。已有的研究表明，睾丸的早期发育阶段和初始快速发育阶段，初生精母细胞在产后15 d左右首次出现在生精小管中[18]。第一次生精波出现在出生后约50 d，而肾小管的直径在出生后约40 d开始增加。曲细精管成熟与LC的数量和功能增加有关[19]。出生后第一个月的LC数量不断增加[20]。L3-10-bp的indel位点与40日龄长白猪的睾丸长轴长、睾丸短轴长、睾丸重均显著相关，而与15日龄长白猪的睾丸长轴长、睾丸短轴长、睾丸重并无显著性关系。这恰好验证了上面所提及的曲细精管成熟与LC的数量和功能增加有关。

4 结 论

本研究在猪Hsd17b3基因上检测出2个indel位点，并通过关联分析发现L3-10-bp indel位点与40日龄长白猪的睾丸长轴长、睾丸短轴长和睾丸重均呈显著相关，提示该位点可作为提高猪繁殖能力育种选择的潜在DNA标记，为Hsd17b3基因在猪遗传育种中的研究和应用提供一定基础和指导。