动物体类固醇激素非损伤性测定的应用

苟娜娜，焦建鑫，黄 梅，尚占环*

(1.兰州大学草地农业科技学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730020；2.兰州大学生命科学学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730000)

环境改变或人为干扰通常会激活脊椎动物神经内分泌轴，导致动物体内应激激素(糖皮质激素)的释放，而糖皮质激素的高低在一定程度上反映了动物对环境的适应能力及机体的防御抗损伤能力[1-3]。动物性腺分泌的性激素还可用来监测其生殖生理状况。因此，动物生理学研究中，类固醇激素水平可用来反映动物的应激水平、生殖状态和健康状况[4-5]。

对于非珍稀动物，可通过表皮收集动物血液或者宰杀动物获取肌肉、肝脏和其他样本以检测动物的内分泌系统是否发生改变[1，6-7]。但对珍稀和濒危动物来说这种采样法存在诸多限制[1]。其次，对动物的捕获、绑定和麻醉等过程本身是一种强烈的外部刺激，会使动物产生强烈的压力。另外，由于野生动物生理参数的研究需要长期监测和反复采样，野生动物主要分布在偏僻地区，不仅隐蔽而且高度警惕，因此在野生动物研究中血液采样不太实用[6]。因此，内分泌的非损伤性检测成为许多研究人员的宝贵工具[1]。

目前，国内关于类固醇激素的非损伤性测定在动物上的研究主要集中在粪便样品，对动物尿液、唾液以及毛发样品中类固醇激素的报道极少。本文通过对类固醇激素的分类及作用进行概述，对唾液、尿液、粪便和毛发样品类固醇激素的非损伤性测定方法及其应用进行对比和总结，以期为同行在后期研究中对不同环境动物体类固醇激素的非损伤性测定提供参考依据。

1 类固醇激素的分类及其作用

1.1 类固醇激素的分类

类固醇激素(steroid hormone)也称为甾体激素，是四环脂肪烃化合物，在线粒体和内质网内胆固醇通过细胞色素P450(cytochrome P450)酶催化形成环戊烷多氢菲母核[8-9]，主要在胎盘、肾上腺皮质、精巢、卵巢等器官细胞，主要由性腺和肾上腺皮质分泌。肾上腺皮质主要分泌糖皮质激素(glucocorticoid)、盐皮质激素(mineralocorticoid)和性激素(sex hormone)三类激素[4，10]。

糖皮质激素经束状带产生，通常包括皮质酮(corticosterone)和皮质醇(cortisol)[10]。不同种类动物分泌不同类型的糖皮质激素，如猪、牛、羊、灵长目类动物和人类等哺乳动物主要分泌皮质醇，而鸟类、啮齿动物、禽类和兔类等主要分泌皮质酮，猫与狗体内二者的分泌量相近[11-12]。盐皮质激素经球状带产生，主要由脱氧皮质酮和醛固酮组成[13]。

脊椎动物的性腺包括雄性睾丸和雌性卵巢。雄激素以睾酮为主，主要通过下丘脑-垂体-睾丸轴的一系列反馈调节产生。雌激素主要受下丘脑-腺垂体-卵巢轴的调节，主要包括雌酮化合物(estrone conjugates，EIC)、雌二醇(estradiol，E2)及雌三醇(estriol，E3)。此外，卵巢也分泌孕激素和少量的雄激素、抑制素[14-15]。

1.2 类固醇激素的作用

糖皮质激素可通过增加新陈代谢产生热量和免疫反应来保持体内平衡，这在动物新陈代谢中起重要作用[16]，还可有效地降低炎症细胞的产生和炎症因子的表达，对于各种机械、化学、病原体和变态反应等引起的炎症反应有抑制作用，有较强的抗炎和抗过敏等免疫调节功能[16-17]，若分泌过量，达到一定程度时，抑制蛋白质合成，加速各种组织中的蛋白质分解代谢率并导致体重减轻[12]。

性腺主要产生配子并分泌激素。雌二醇的水平与雌性动物的发情、交配、排卵以及妊娠都有一定的关联性。此外，孕酮在维持其生殖内分泌平衡方面起着重要作用。不仅可抑制妊娠期的再发情，而且子宫内高浓度的孕酮有利于胚胎的稳定，使受精卵正常着床，降低流产率[13，18]。而且，孕酮通过作用于中枢神经系统来稳定子宫，抑制催产素的释放和子宫肌肉的自发活动[10，15，19]。睾酮的主要功能是促进雄性动物生殖器官的发育，维持雄性动物第二性征和功能，促进精子的形成、发育成熟，并阻止生精细胞凋亡[14-15]。目前关于野生动物性激素的研究，主要是睾酮、孕酮和雌二醇。

2 类固醇激素的非损伤性测定及其在动物中的研究应用

2.1 类固醇激素的非损伤性测定

非损伤性取样(Noninvasive sampling)通过收集唾液、尿液、粪便、毛发、脱落羽毛、卵壳和鳞片等样品，无需捕捉，对动物正常生活干扰低的情况下来研究类固醇激素代谢物含量的变化及野生动物的行为[20-21]。在唾液中，糖皮质激素产生的变化可以在数分钟甚至数秒钟检测到，非常适合监测激素的短期变化[22]。相比之下，粪便和尿液可以反映数小时甚至数天激素的分泌状况。但是如果样品无法定期收集，可通过测量毛发样本中激素水平，毛发缓慢增长意味着可测量数周甚至数月的激素含量，非常适合监测激素的长期变化[23]。总之，各种方法有着各自的优缺点，哪种方法监测动物类固醇激素代谢物含量的变化，不仅取决于研究的便利性，而且还取决于与研究问题相关的其他考虑因素(表1)。

2.2 类固醇激素非损伤性测定的研究应用

2.2.1 唾液类固醇激素 相对于其它三种非损伤性采样方法，收集唾液研究野生动物类固醇激素的变化受到多方面条件的限制，具有很强的挑战性。关于唾液类固醇激素的研究主要在一些驯养动物以及圈养动物，通过检测不同外界环境影响下的唾液类固醇激素的水平，以此说明机体精神和身体上受到的压力。例如，可通过分析马唾液皮质醇浓度评估马对潜在压力的反应，研究表明在马术训练中，几乎每一个训练项目，即应激源都与唾液皮质醇浓度的增加有关[33-35]。

同血液皮质醇一样，马的唾液皮质醇浓度很好地反映了皮质醇释放的昼夜节律性[36]。即使在相同环境下，唾液皮质醇易受到动物生殖状况以及个体性别的影响。例如，Aurich等[37]研究表明，在繁殖季节4月和5月，去势马的唾液皮质醇浓度分别为1.3和0.9 ng/mL，而种马的皮质醇浓度显著提高，分别达到2.1和2.6 ng/mL。对于圈养动物来说，唾液非常适合监测动物短期类固醇激素的变化，有利于随时了解动物的生存状态，并对动物进行管理。例如，朱洪龙等[26]研究了断奶仔猪在不同饲养和管理方式下的唾液皮质醇水平，以改善断奶仔猪的福利。

2.2.2 尿液类固醇激素 一般来说，从自由生活的物种中收集尿液极其困难，除了一些熊科动物及树栖灵长目类动物。刘德成等[38]研究表明，雌性黑熊(Ursusthibetanus)在发情前后尿液中雌二醇含量均有一定程度的波动，发情期雌二醇含量为(0.053±0.037 ng/mg Cr)，与发情后期雌二醇(0.012±0.012 ng/mg Cr)以及发情间期均值(0.014±0.010 ng/mg Cr)相比差异极显著，与发情前期(0.026±0.023 ng/mg Cr)相比差异显著，发情前期与发情后期差异显著。对于同一物种，郑程莉等[39]测量了6头圈养雌性黑熊在妊娠中后期连续2个月尿液孕酮含量的变化，以指导妊娠期黑熊的圈养。其中试验组3头圈养繁殖母熊孕酮最高达39.54 ng/mL，最低值为2.45 ng/mL，在11月可达10 ng/mL以上，而对照组3头取胆母熊孕酮含量最高值32.62 ng/mL，最低值0.05 ng/mL，孕酮含量在11月和12月均在10 ng/mL以下。相比于繁殖母熊，3头取胆母熊孕酮显著低于试验组，且呈现无规律的变化。这些研究对于了解种群中个体发育期间的变化、生殖、营养状况、福利和保护等都起重要的指示作用。

对于一些树栖灵长目类动物的研究，潘昌滨[40]通过分析白掌长臂猿(Hylobateslarvestitus)和戴帽长臂猿(Hylobatespileatus)尿中的类固醇激素浓度，建立激素浓度折线图计算其生殖周期，通过尿中孕酮折线图分析出它们的妊娠期都为195 d，而通过尿中雌二醇葡糖苷酸浓度图得出其妊娠期分别为192 d和197 d。Jaeggi等[41]研究表明，红尾猴在群间交配(IGEs)过程中，早期收集的样本皮质醇的变化更为明显，后期收集的样本睾酮的变化更为明显。这些研究对于评估不同灵长目类动物的行为、生殖、社交和适应性等都起到重要的指导性作用。关于尿液类固醇激素保存的研究，陈浩春等[42]发现即使对同一物种，不同类型的尿液类固醇激素保存时效性也不同。例如，在4 ℃时，雄性川金丝猴尿液睾酮、雌性尿液睾酮、孕酮的保存时效为7 d左右，雌性尿液雌二醇的保存时效在3 d以内。由此可见，尿液的保存方法也是前期研究中需重视的一部分，对于后期的结果分析起到决定性的作用。

2.2.3 粪便类固醇激素 粪便非损伤性方法已广泛应用于动物激素与行为相关性、压力与动物福利、繁殖生理、生态生理、行为生态学、保护生物学以及生物医学等相关方面的研究中[5]。在20世纪70年代末开始使用非侵入性测量粪便类固醇代谢物的方法来评估鸟类[43]的内分泌状况，随后被用于越来越多的物种，包括哺乳动物(虎[44-45]、灵长目类动物[46-47]、大熊猫[48]、犀牛[49]、熊[50])、鸟类[51-52]、爬行动物[53]等。因此在过去的20多年里，粪便中类固醇激素代谢物的研究已是一种广泛接受的技术。

Dantzer[54]等强调了内在的因素(如性、生殖状况、年龄、最近的经历)和生态因素(如捕食、食物供应、降雪)，以及它们自身或与人为干扰的相互作用，都会影响生理应激反应。在一定程度上，自由生活的动物体内糖皮质激素的增加能提高其生存和繁殖能力。Newell-Fugate等[55]发现雄性野狗和雌性野狗粪便中雄激素和雌激素呈现季节性的变化，粪便中的雄激素在初夏(246.4±14.5 ng/g)显著高于初冬(218.6±13.4 ng/g)，在夏季和冬季，雌性野狗季节性地交配。Scarlata等[56]可通过研究濒危侏儒兔(NetherlandDwarf)不同的繁殖季节中粪便类固醇激素的分泌状况，以制定合适的管理策略来监测动物福利和增加繁殖。Abaigar等[57]表明，尽管物种是特异性的，但是季节是影响不同哺乳动物类固醇激素变化的主要因素，干旱季节导致激素代谢物浓度显著升高，而潮湿季节使激素代谢物浓度显著降低。可见，温血动物生活在季节性变化的环境中面临着保持高体温和食物可利用性的能源危机挑战中，其机体在生命周期中发生一系列的生理和代谢变化，以适应生存环境的改变。

即使同一物种不同年龄、性别和任何生活史阶段等都可能导致激素代谢物浓度的差异。例如，Seraphin等[58]发现年龄对雄性黑猩猩的糖皮质激素和雄激素的产生有显著影响。Valenzuela-Molina等[59]发现怀孕的雌性蓝鲸平均粪便孕酮代谢物浓度为1292.6415.6 ng高于未孕和哺乳期的雌性蓝鲸(分别为14.03.7 ng和23.05.4 ng)。毕温磊[1]发现不同年龄和性别的大熊猫个体间，呈现年龄越小则变化越明显，说明环境变化可能是引起其皮质醇变化的原因之一，即年龄越小这种环境引起的应激性越明显。

此外，一定程度上，动物的栖息地受到干扰影响其觅食和生殖，增加了动物的生理应激反应，这些累积效应可能成为限制动物生产力的因素。例如，郭彦娇[13]发现观赏笼内朱鹮(Nipponianippon)粪便中皮质酮水平与当日游客量存在显著相关性(r=0.853)，说明游客量影响了朱鹮的应激性。王菊霞[60]研究表明不同天敌的粪便气味对高原鼠兔粪便中的皮质酮、皮质醇和孕酮浓度均有不同程度的影响，其中，不同天敌的粪便气味对皮质酮的含量呈现显著的二次函数关系(R2≥0.756)，皮质醇含量随着处理时间的延长呈显著的正相关(R2≥0.4959)，孕酮浓度随着处理时间的增加而下降，二者间表现出显著的负相关关系(R2≥0.6913)。

2.2.4 毛发类固醇激素 相较于其他三种类固醇激素的研究，毛发皮质醇激素的研究起步较晚，最早研究毛发皮质醇激素的是Koren等[61]在野生蹄兔上的研究，相对于国外来说，毛发皮质醇激素在国内野生动物上的研究相对来说比较欠缺。在动物上的研究有猕猴[62]以及啮齿类动物[63]，其重点主要是在方法验证上。大多数野生动物和家养动物的研究只测量了毛发中的皮质醇，而对其他类固醇激素，如睾酮，雌二醇，孕酮等指标的测定几乎没有，而这些指标的测定可提供动物生殖生态学的相关信息。

尽管国外关于毛发皮质醇激素的研究相对来说比较多，但目前为止，毛发皮质醇激素的研究仍处于不成熟的阶段，许多可变因素的影响有待于进一步研究。最有争议的是毛发皮质醇激素浓度是否随着毛发的生长而变化，Kirschbaum等[64]研究表明，在长度为18 cm的毛发，从头皮到发梢的位置，每3 cm为一个片段，从一个片段到下一个片段，平均皮质醇水平下降30%～40%，毛发皮质醇浓度显著降低。而同样的研究在恒河猴中，近端(111.9±10.6 pg/mg)和远端(108.6±10.4 pg/mg)的皮质醇浓度差异不显著[65]。此外，自然发色对皮质醇浓度的影响也最有争议性，Bennett等[66]研究表明黑狗比非黑狗的毛发皮质醇浓度低，发现毛发颜色和皮质醇浓度之间有一定的关系(r=0.47，P=0.001)。而同样的研究，深色毛发比浅色毛发熊的皮质醇含量高[67]。因此，黑色素是否对毛发皮质醇激素是否有影响有待进一步研究。

毛发皮质醇浓度在许多物种上与采样部位有关，突出显示了毛发取样位置标准的重要性。例如，Ashley等[68]通过采集驯鹿身上3个位置的毛发，其结果表明肩部和臀部毛中的皮质醇浓度显著高于颈部。而Terwissen等[69]发现，山猫毛发皮质醇在年龄和性别之间没有变化，但在脚和腿部不同区域的变化比个体之间的变化更大。这些研究进一步说明从陷阱或巢穴中随机收集毛发存在一定的问题。

目前，毛发皮质醇已经广泛用于检测野生动物皮质醇水平的非侵入性测量，并从多方面评估动物对不同压力的响应状况，如人为干扰、季节性、性别、年龄等影响因素。Roth等[70]通过研究几周和几个月内人类的相互作用对狗皮质醇水平的影响，反映狗在长期活动过程中受到的压力。Comin等[71]研究表明奶牛由冬季室内到夏季放牧条件下，在夏季开始放牧7 d的毛发皮质醇浓度为(2.1±0.10 pg/mg)，放牧40 d毛发皮质醇浓度为(2.9±0.17 pg/mg)，毛发皮质醇的上升可以说明动物对环境变化的内分泌反应。Bechshøft等[72]研究表明，雌性北极熊的毛发皮质醇平均浓度高于雄性(雌性11.0 pg/mg，雄性7.3 pg/mg)，但皮质醇浓度与年龄或采样年份之间没有显著相关性。Faustini等[73]研究表明，马驹在30日龄时平均毛发皮质醇浓度一般为35.17 pg/mg，显著低于出生时期平均毛发皮质醇浓度60.37 pg/mg。

3 展 望

目前，国内外对类固醇激素水平的研究主要利用动物粪便，在一定程度具有便利性，但粪便中的类固醇激素是类固醇激素代谢物，而且不同物种滞后时间不同，这样使得不同研究结果没有对比性。对于圈养动物或一些树栖灵长目动物来说，利用唾液或尿液来研究类固醇激素的水平有一定的优势，但对于野生动物而言存在诸多限制。与其他非侵入性测量法相比，毛发样品中类固醇激素在毛发中保持完整，有助于分析。此外，毛发样品可以在室温下放置几个月甚至几年不降解，它不仅适合监测动物受到的长期压力，而且可以有效了解动物的生理病理过程，并随时对动物进行健康管理。

通过以上类固醇激素非损伤测定的研究应用可以得出，相较于野生珍稀动物，对家养动物的研究甚少。家畜的养殖朝着规模化、集约化的舍饲养殖方向发展，虽然这种养殖方式具有不受限于天气条件、易于管理、减少对生态环境破坏的优点，但是舍饲家畜在生存过程中不仅要面对一系列的被动处境，包括食物短缺、水源匮乏、环境条件等，还要克服争夺食物、竞争生存空间、运输等的压力。因此养殖中动物福利越来越受到人们的关注。对不同的家畜选择合适的非损伤性测定方法，通过持续监测不同环境、不同生殖阶段以及不同性别家畜机体类固醇激素的变化，对不同生活阶段的家畜提供健康合理的管理措施，将在推动动物福利的过程中获取良好的生产效益。