动物脂代谢细胞模型研究进展

赵海东，邬明丽，王淑辉，孙秀柱，2*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 草业与草原学院，陕西 杨凌 712100)

长期以来，脂肪一直都被视为一种能量贮存组织，随着研究的不断深入，其作为一种重要的内分泌器官和免疫器官也逐渐被众多研究者证实[1-2]。目前针对人类脂肪代谢的研究渐趋深入，同时针对肉类食品的低脂化相关研究也正逐步增多，因此建立体外脂肪细胞模型成为脂肪代谢研究的重要基础。脂肪细胞模型建立过程中存在物种、年龄、组织部位、培养方式等差异，造成脂肪细胞模型建立成功率低、难度大、实验研究可重复性差等问题。本文拟通过对不同动物脂肪细胞模型建立过程中的方法进行综述，并结合本实验室脂肪细胞模型建立经验，梳理出在不同物种当中建立脂肪细胞模型的可行方案，并对这些细胞模型的生物学差异性进行比较，为脂代谢相关研究提供更为合适的脂肪细胞培养方案，为脂代谢细胞模型生物学差异研究提供一定的参考依据。

目前体外脂代谢研究通常采用细胞系和原代脂肪细胞进行培养。脂肪细胞系可划分为3类，以C3H10T1/2和NIH3T3为代表的干细胞类型细胞系，以3T3-L1和3T3-F422A为代表的白色脂肪来源前脂肪细胞系和以PZA6为代表的棕色脂肪来源的前脂肪细胞系。原代培养按照物种可分为模式动物脂肪细胞模型和家养动物细胞模型；按细胞组织代谢类型可分为白色、棕色和米色脂肪细胞模型。前脂肪细胞系在用于脂代谢相关研究中不能体现出年龄、性别等差异。因此原代脂肪细胞培养是脂代谢研究的一个重要环节，将为脂代谢研究的不断深入提供有力的研究模型。

1 脂肪细胞模型分类

1.1 多潜能干细胞类型脂肪细胞系

C3H10T1/2是小鼠未分化的间充质干细胞，除成脂分化以外，还可通过不同方式诱导为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞等[3-4]。NIH3T3是小鼠胚胎成纤维细胞系，具有诱导成脂分化能力和较高的转染效率，多用于基因表达相关研究[5]。二者为不定向的(non-committed)细胞系，转基因表达C/EBPα和PPARγ时，这些细胞能被诱导分化成脂肪细胞。用去甲基化试剂5-氮胞苷处理鼠胚胎细胞C3H10T1/2，可使一些细胞转变成TAL细胞系[6]。

1.2 前脂肪细胞系

3T3-L1细胞系分离自Swiss小鼠的脂肪纤维细胞，是使用范围最广的脂代谢细胞模型，主要应用于胰岛素敏感性与抵抗[7]，脂质合成与降解代谢[8]，脂肪与其他组织的代谢关系等相关研究[9]。其经典培养方式为含10%牛血清和1%双抗的DMEM培养基，但其诱导分化培养条件在不同的研究中差别较大。鸡尾酒法在第一阶段采用500 μmol/L，M3-异丁基-1-甲基黄嘌 (IBMX)、0.25～1 μmol/L地塞米松与1～10 μg/mL 胰岛素联合诱导，联合诱导时间存在一定差异，第二阶段则用相同浓度的胰岛素单独诱导。有研究者针对其诱导分化条件进行优化，发现其中IBMX的用量、联合诱导时间与胰岛素单独使用量是影响3T3-L1细胞分离培养的关键因素[7]。3T3-F442A细胞系和OB17细胞系均分离自小鼠，与3T3-L1细胞具有完全相同的培养条件和分化方式。除此以外，Hugo等[10]建立了能够产生催乳素和催乳素应答的LS14细胞系；Wolins等[11]建立了具有快速分化能力的OP9细胞系，能够很大程度上加快脂肪代谢体外研究过程。

1.3 棕色化脂肪细胞系

通过婴儿皮下棕色脂肪组织为来源构建的PZA6细胞系是现阶段使用率较高的棕色化脂肪细胞系[12]。该细胞系在胰岛素等外源刺激下能够诱导生成含有脂滴的脂肪细胞，同时具有较高的UCP1表达。分化过程中需要添加高质量的噻唑烷二酮，能够诱导米色脂肪的生产[13]。该细胞系在诱导过程中存在较大的异质性，同时含有棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞，对分子机制的研究工作存在一定的困扰。除此以外，现阶段还存在BFC-1、HB2、RBM-Ad、HIB 1B、T37i等棕色脂肪细胞系[14]。

1.4 原代脂肪细胞模型

原代脂肪细胞根据其培养方式和同质性程度可分为基质血管成分细胞(Stromal vascular fraction，SVF)，脂肪干细胞(Adipose derived stem cells，ASCs)和去分化脂肪细胞(Dedifferentiated fat cells，DFAT)。SVF细胞指通过消化法建立的脂肪细胞异质群，其细胞模型建立时间短，可操作性强，是最常见的脂肪细胞模型。ASCs细胞经过了纯化过程，具有较强的同质性，且拥有多向分化潜能，可诱导成脂、成软骨和成骨[15]。DFAT细胞经过天花板培养法以成熟脂肪细胞为供体，通过体外培养去分化获得拥有一定增殖和分化能力且同质性较强的前脂肪细胞模型[16]。3种细胞培养方案均能够应用于白色脂肪细胞的培养过程当中，但棕色脂肪细胞因其仅含有众多小脂滴，其密度较成熟白色脂肪高，因此棕色脂肪细胞模型建立多采用消化法[17]。

2 细胞模型建立与分化

2.1 消化法建立脂肪细胞模型

目前酶消化法是可行性最高、效果最稳定的原代脂肪细胞模型建立方法，通过机械剪碎、酶消化、过滤并结合差速贴壁纯化等方式获得SVF细胞，具有广泛的物种通用性。该方法建模速度较快，但前脂肪细胞纯度受到一定的限制，同时细胞活力和细胞传代能力也较组织块法有所下降。现阶段并没有一种标准化的采用消化法建立脂肪细胞模型的方案。因此，众多研究者通过结合差速贴壁等方法试图提升其前脂肪细胞纯度，通过优化酶的使用量、消化时间、种类和进行不同的组合减少长时间消化对细胞产生的伤害。有研究发现，细胞筛孔目大小与物种间细胞大小差异和不同脂质积累程度造成的细胞大小差异具有一定的联系，且长时间和高速离心对脂肪细胞模型建立过程中细胞活性存在较大的伤害，故推荐较短离心时间和较低离心速度[18]。

2.2 组织块法建立脂肪细胞模型

组织块法培养脂肪细胞模型也广泛应用于脂代谢相关研究。通过分离脂肪组织，剥离结缔组织和血管等杂质，剪为1 mm3左右组织块进行倒置培养，待贴牢后正置培养至脂肪组织细胞由组织中迁出。有研究者发现，低剂量辐射处理能够提升天花板培养法脂肪细胞模型的活性[19]。脂肪细胞外周结缔组织膜结构束缚细胞迁出，基于实验室前期研究，当解除外周结缔组织包被后，脂肪细胞迁出能力得到了极大的提升。脂肪组织来源同样对组织块法建立脂肪细胞具有极其明显的差异，幼龄动物脂肪组织迁出能力强，成年动物则很难迁出前脂肪细胞。有研究表明组织块法培养脂肪细胞，在后续脂肪细胞分化过程当中表现出分化同步性差和分化能力差异大等问题[18]。基于上述观点，为充分利用组织块培养法建立脂肪细胞模型细胞活力强的优点，结合差速贴壁等手段对其进行细胞纯化将是一种可行的策略。

2.3 其他方法建立脂肪细胞模型

2.3.1 二次天花板法与改良天花板法 二次天花板法先通过消化法结合低速离心获取密度低于消化介质的含有大量脂滴的上层成熟脂肪细胞，将细胞悬液以倒置培养的方式使得细胞于天花板贴壁，通过一定时间的去分化过程完全贴壁后再正置培养，不断增殖获得DFAT细胞。此种方式的优势为获得细胞模型同质性较强，但培养液消耗极大。有研究者通过在培养皿中放置盖玻片的方式代替传统的天花板法，此法极大的减少了培养基的使用量，且具有较好的细胞模型建立效果，但天花板培养法较消化法获得细胞具有较差的分化能力[20]。所以，细胞纯度提升和细胞分化能力下降的矛盾仍是天花板法培养脂肪细胞的亟待解决的问题。

2.3.2 差速贴壁法 差速贴壁法主要应用于脂肪细胞纯化过程，利用成熟脂肪细胞、前脂肪细胞和肌肉细胞之间的贴壁速度差异分离出纯度较高的脂肪细胞。主要应用于肌内脂肪细胞分离工作[21]。但其分离效果受细胞状态影响较大，细胞活性差异导致的贴壁速度差异对富集的细胞纯度产生了较大的影响，多次差速贴壁可能是一种解决原始方案中细胞异质性的可行方式。

2.3.3 其他培养方式 结合脂肪细胞相关特性和其他异质性细胞的纯化方式，提出了几种可行的方式：高纯度的前脂肪细胞模型建立可采用细胞标志maker进行流式筛选[22]；充分利用不同细胞密度差异通过差速离心或者密度梯度离心等方式获得较为同质化的细胞[23]；通过将原代脂肪细胞建立细胞系的方式获得永久保存的细胞系[24]。

3 原代脂肪细胞模型生物学差异

3.1 不同动物脂肪沉积部位差异

物种间脂肪组织发育方式存在差异，有报道称脂肪组织可能的来源是骨髓间充质干细胞，因脂肪干细胞和间充质干细胞具有极大的相似性[25]。不同动物的脂肪组织发生部位不同，猪脂肪组织发源于背侧，而以牛为代表的反刍动物脂肪组织发生于腹侧，在脂肪沉积的过程当中，脂肪组织不断迁至全身不同部位。不同动物具有不同的脂肪组织形式，猪具有较多的皮下脂肪沉积，且皮下脂肪组织具有明显的分层现象，牛和鸡具有极强的腹部脂肪沉积能力，但鸡并不具有沉积皮下脂肪的能力，绵羊和山羊具有较强的肌内脂肪和肌间脂肪沉积能力，但绵羊具有独特的尾脂沉积能力。不同脂肪沉积部位使得在脂代谢模型建立上具有一定的选择性和特异性。细胞在体外培养过程中仍能保存一定的体内特征，所以通过以不同部位脂肪组织为来源建立脂肪细胞模型可能对脂肪组织的发生过程和不同部位脂肪代谢差异具有一定的研究意义。

3.2 动物脂肪沉积的性别差异

受类固醇代谢和其他两性差异代谢的影响，脂肪沉积在不同物种间具有较大的差异性，在人类当中，性别差异导致的脂肪沉积部位不同尤为明显，男性多趋向予苹果型肥胖，女性更趋向于梨形肥胖。Aksu等[26]研究表明，以女性脂肪组织为供体的细胞模型较男性具有较弱的分化能力、较低的死亡率和较快的生长速率。体外建立脂肪细胞模型同样会部分保留活体动物部分类固醇激素代谢效应。

3.3 白色、棕色和米色脂肪组织差异

脂肪组织通常可分为白色脂肪组织、棕色脂肪组织和米色脂肪组织，其在组织功能和形态学上存在较大差异。白色脂肪组织将甘油三酯储存于细胞质中的脂滴中，能够分泌大量的激素及细胞因子影响和调控其他组织和机体整体代谢，过多的白色脂肪沉积可能导致代谢平衡紊乱，产生脂代谢相关病症[27]。白色脂肪组织和米色脂肪组织均由Myf5-细胞型分化而来，棕色脂肪来源于Myf5+细胞型。米色脂肪和棕色脂肪拥有相似的细胞结构，二者均具有较多的线粒体结构，米色脂肪可视为白色脂肪在冷刺激下经过一系列变化趋向于棕色脂肪的现象，二者均能够检测到高水平的UCP-1表达。分别以白色脂肪组织和棕色脂肪组织所建立脂肪细胞模型具有完全不同的生物学特性。有研究者发现，体外通过药物诱导可促进白色脂肪的棕色化进程[28]。

3.4 动物年龄对细胞活性的影响

供体年龄对原代脂肪细胞模型的建立具有较大的影响。众多研究发现，供体年龄与脂肪组织细胞活性和迁出能力成负相关[29]。取材于幼龄的动物脂肪组织在脂肪细胞模型建立过程中表现出较强的分裂能力和较好的生物学形态结构[30]。这种“增殖”活性并不等同于细胞在体外增殖速率的差异，主要表现为构建细胞模型的难易程度和细胞产量，造成这种差异的原因可能是随着年龄的不断增长，脂肪干细胞的衰老基因表达量上升，且细胞内环境稳态的维持能力明显下降[31]。但部分研究者发现，脂肪间充质干细胞的衰老与年龄没有必然的联系，且脂肪细胞的体外增殖能力和分化能力与其供体年龄并不具有显著相关关系。现阶段，研究者对供体年龄与脂肪细胞模型建立的关系研究并不统一，未能对以幼龄动物为供体建立脂肪细胞模型的优势进行合理的生物学鉴定与分析[32]。

3.5 脂肪细胞的分化与去分化

脂肪细胞离体后，解除机体激素和营养水平等调节因素，其在结构功能上会发生一定程度的生物学变化，这种变化并不能完全解除机体本身对原代细胞造成的影响。尽管很早就有研究报道，前脂肪细胞需要通过G0期阻滞才能够具有分化潜能[33]，但现阶段研究发现接触抑制并非脂肪细胞分化的必要条件。不可否认的是，细胞分化的核心信号是染色质表观遗传模式的转变，由分裂状态转移至分化状态。有研究表明脂肪细胞分化的表观遗传事件发生于解除抑制期并非诱导期[34]。同时研究发现，脂肪细胞体外分化阶段被分割为两个相对独立的阶段，细胞因接触抑制获得分化潜能阶段和激素等细胞分化诱导因子刺激下执行分化过程阶段[35]。

基于实验室研究基础发现，在一定时间和代数内，牛脂肪细胞在体外培养代数与时间的延长会使细胞模型更多的脱离生物机体对其造成的影响，不同组织来源的细胞模型会趋向生物学统一。研究发现，其中甲基化的变化，细胞线粒体的消亡和再生[36]，血清细胞生长因子的缺失可能是体外脂肪细胞去分化和再分化的重要原因[37]。

4 小 结

肥胖正在逐渐侵蚀人类的健康，但迄今为止，对于这一问题的解决方案并不完全成功，侧面也说明了现阶段研究者对脂肪细胞生物学和生理病理学的相关研究还存在不足。为了更好地了解脂肪细胞的功能，我们需要不断改进脂肪细胞模型，使其在表达体内状态时具有高度的保真度，并具有不同的实验应用范围[38]。随着脂肪沉积与脂代谢研究的不断深入，研究者对于脂肪组织的认识也在逐渐产生变化，起初将脂肪组织仅视为一种能量贮存器官，到现阶段将其同时视为一种免疫器官和内分泌器官[41]。脂肪细胞模型是脂代谢相关研究的重要媒介，通过建立原代脂肪细胞模型和利用现有的众多细胞系，研究者对人类脂代谢相关疾病和动物脂肪沉积相关功能有了长足的认识。深刻认识脂肪组织的物种间差异、部位差异、组织结构差异、年龄差异和性别差异等因素，对原代脂肪细胞模型建立具有十分重要作用，也将为更好的进行脂代谢和脂肪沉积相关研究铺平道路。