HPLC法测定盐酸普拉克索的有关物质

于 峰，张曼红，刘建洋

(山东绅联药业有限公司，山东 济南 250000)

盐酸普拉克索(pramipexole hydrochloride)是一种非麦角类选择性多巴胺(DA)受体激动剂，与多巴胺受体D2亚家族结合具有高度的选择性和特异性，对其中的D3受体有优先亲和力，并具有完全的内在活性，能有效改善早期及晚期帕金森病的运动症状，延缓和减轻左旋多巴导致的相关运动并发症的发生，使用范围广，安全性好，目前已成为抗帕金森病治疗的一线药物[1-3]。本品的原研厂家为德国勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingellheim)，是2007年在我国批准上市的新型抗帕金森病药物。临床上与左旋多巴联合使用可有效改善中晚期帕金森病患者的运动状态，同时可缓解帕金森病患者伴发的抑郁症状，避免因长期使用左旋多巴造成的神经损害[4]，延缓治疗时间及降低使用剂量，可大大提高患者的生活质量[5-6]。本试验采用高效液相色谱法测定盐酸普拉克索的有关物质，此方法灵敏度高，专属性强，准确度高，可用于盐酸普拉克索的有关物质检查。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-15C高效液相色谱仪(SPD-M20A检测器(DAD检测器))；QUINTIX125D-1CN电子天平(赛多利斯公司)；FE-28台式酸度计(梅特勒-托利多)。

1.2 试药

盐酸普拉克索样品(自制，批号：191201、191202、191203)；盐酸普拉克索对照品(化 学 名：(S)-2-氨基-6-丙氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑二盐酸盐一水合物，来源：U.S.Pharmacopeia，批号：G0L469，含量：每1mg含C10H17N3S·2HCl·H2O0.998 mg)；杂质A对照品(化学名：(6S)-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2,6-二胺，来源：Toronto Research Chemical Inc.，批号：21-XJZ-69-1，含量：98 %)；杂质B对照品(化 学 名：6S-N,N-二异丙基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑-2,6-二胺二盐酸盐，来源：TLC PharmaChem,Inc.，批 号：1392-083A8，含量：98.5 %)；邻硝基苯基硫乙酸对照品(化 学 名：(2-硝基苯基)硫代乙酸，来 源：Cato Research Chemicals Inc.，批 号：C3D-1077-1401，含量：98.7 %)；杂质Ⅰ对照品(化学名：邻硝基苯磺酸，自制，批号：Y191001，含量：88.9 %(滴定))；杂质Ⅱ对照品(化学名：(S)-N,N-(4,5,6,7-四氢苯并噻唑-2,6-二基)双(2-硝基苯磺酰胺)，自制，批号：Y181201，含量：94.0 %)；杂质Ⅲ对照品(化学名：(S)-N,N-二丙基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑-2,6-二胺，自制，批号：Y191203,含量：98.6 %)；杂质Ⅳ对照品(化学名：(S)-2-硝基-N-正丙基-N-(2-(丙氨基)-4,5,6,7-四氢苯并噻唑)苯磺酰胺，自制，批号：191205，含量：98.9 %)；杂质Ⅴ对照品(化学名：(S)-N-(2-(二丙氨基)-4,5,6,7-四氢苯并噻唑)-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺，自制，批号：191102，含量：96.8 %)；杂质Ⅵ对照品(化学名：(S)-2-硝基-N-(6-(丙氨基)-4,5,6,7-四氢苯并噻唑-2-基)苯磺酰胺，自制，批号：191104，含量：99.6 %)；乙腈(色谱纯，ASTOON，4L/瓶)；水(市售纯净水，杭州哇哈哈哈集团)，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

取盐酸普拉克索约15 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸普拉克索溶液。

取中间体1((S)-N-(2-氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑-6-基)-2-硝基苯磺酰胺)约15 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加乙腈适量溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为中间体1溶液。

取中间体2((S)-N-(2-氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑-6-基)-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺)约15mg，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈适量溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为中间体2溶液。取杂质Ⅰ约5 mg，置50 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅰ溶液。

取杂质Ⅱ约10 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈适量溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅱ溶液。

取杂质Ⅲ约5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈适量溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅲ溶液。

取杂质Ⅳ约5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈适量溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅳ溶液。

取杂质Ⅴ约10 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈适量溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅴ溶液。

取杂质Ⅵ约5 mg，置50 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅵ溶液。

取杂质A约10 mg，置50 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质A溶液。

取杂质B约5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈适量溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质B溶液。

取邻硝基苯硫乙酸约5 mg，置50 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为邻硝基苯硫乙酸溶液。

取上述溶液各1 mL，混匀，作为混合溶液。

2.2 色谱条件与系统适应性

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，以pH值 3.0缓冲液(取辛烷磺酸钠5.0 g与磷酸二氢钾9.1 g，加水1000 mL使溶解，用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，以pH值 3.0缓冲液-乙腈(30∶70)为流动相B，梯度洗脱(0 min～40 min，70 % A；40 min～45 min，0 % A；45.1 min～55 min，70 % A)流速1.5 mL·min-1，柱温35 ℃，检测波长264 nm，进样量5 μL，稀释剂为pH值 3.0缓冲液-乙腈(80:20)。试验结果见表1，色谱图见图1。在选定试验条件下各杂质均能实现基线分离。

表1 系统适应性试验结果

图1 专属性试验高效液相色谱图

2.3 专属性试验

取本品约15 mg，精密称定，按表2的破坏方法进行强制降解试验。破坏后放冷，加稀释剂稀释至10 mL，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取各供试品溶液5 μL，分别注入液相色谱仪，试验结果见表3。由试验结果可知，本品在高温、酸、碱、光照降解条件下未见明显杂质产生，较为稳定；氧化降解条件下，主要降解产物为氧化降解产物1和氧化降解产物2，分别占1.519 %和0.478 %。主峰与杂质之间均能实现基线分离，表明改方法专属性良好。并根据降解前后峰面积计算物料平衡，结果见表3。

表2 盐酸普拉克索强制降解试验破坏条件

表3 强制降解试验结果(面积归一化法)

2.4 线性试验

按线性试验要求，配制系列浓度的的线性溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样，以溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归，同时计算各杂质的定量限(LOQ)和检测限(LOD)，结果见表4。

表4 线性试验结果

2.5 精密度和稳定性试验

采用2名实验人员在不同时间、不同设备上，分别平行测定6份供试品溶液，其中杂质A和杂质B均未检出，计算邻硝基苯硫乙酸、其他最大单杂和总杂质含量的RSD(n=12)分别为4.6 %，2.0 %和2.3 %。

取新配制的对照品溶液和供试品溶液，室温放置12小时，并于0，2，4，8，12 h时，精密量取各溶液5 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液主峰面积各时间点RSD为0.48 %，与0 h相比，无显著性差异。供试品溶液中各时间点最大单个杂质和总杂质含量均小于0.1 %，RSD均为1.0 %，其他杂质均未检出。结果表明，室温条件下，对照品溶液和供试品溶液均在12 h内稳定。

2.6 回收率试验

取盐酸普拉克索适量，精密称定，加稀释剂制成每1mL含1.5μg的溶液，分别加入0.2%、1.0%、1.5%的杂质对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样，按外标法以峰面积计算，邻硝基苯硫乙酸、杂质A、杂质B的平均回收率(n=9)分别为99.1%，101.5%，98.2%，RSD分别为1.5 %，2.1 %，1.2 %。

2.7 样品测定

取三批自研产品(批号：191201、191202、190203)，按“2.2”项下的色谱条件进行试验，邻硝基苯硫乙酸按外标法以峰面积进行计算，杂质A、杂质B和其它杂质按主成分自身对照法计算。结果见表5。

表5 样品测定结果 %

3 讨论

3.1 检测波长的选择

根据合成工艺，盐酸普拉克索在264 nm处有最大吸收，中间体1、中间体2、杂质A、杂质B、邻硝基苯硫乙酸、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ各工艺杂质均在264 nm波长附近有最大吸收，杂质Ⅱ在290 nm处有最大吸收。根据降解试验结果，主要降解杂质氧化产物1和氧化产物2的特征吸收，二者在264 nm处均有较强吸收。因此，选择264 nm作为本试验有关物质检测用波长，可将各杂质有效成分检出，且分离度符合要求。

3.2 色谱条件

本试验对流动相B中pH值 3.0缓冲液和乙腈的不同比例进行了筛选，并对梯度洗脱程序进行了考察，最终确定了流动相比例和梯度洗脱程序。在选定色谱条件下，各色谱峰之间均能达到有效分离，且各色谱峰纯度均达100 %。

3.3 杂质含量计算方法

杂质A、杂质B的校正因子分别为0.6、1.0，杂质B校正因子在0.9～1.1范围内，为严格控制产品质量，将杂质A、杂质B和其他未知单杂均采用不加校正因子的主成分自身对照法进行计算。邻硝基苯硫乙酸校正因子为1.0，邻硝基苯硫乙酸为遗传毒性杂质，为严格控制产品质量，其含量采用外标法以峰面积进行计算。