生熟大黄药对对顺铂所致肾损伤小鼠的影响

琚皇进，杨 柱，唐东昕，罗 莉，龙奉玺，王镜辉，郭 斌

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学 第一附属医院，贵州 贵阳 550002；3.德江县民族中医院，贵州 铜仁 565200)

顺铂(DDP)作为恶性肿瘤临床常用的化疗药物，由于具有严重的肾毒性，使得临床研究一度停滞。目前大多数肿瘤的治疗首选药物仍为顺铂，如膀胱癌、卵巢癌等[1]。我国由于顺铂导致的肝肾毒性、骨髓移植、神经毒性、胃肠道反应等，同样困扰着广大临床医生和患者。由于顺铂严重的肾毒性导致患者生活质量严重下降，迫使一些患者中断化疗而导致病情进一步恶化。顺铂在肾脏中的代谢特点具有高聚集性，故其剂量越高肾脏毒性越强，迫使临床使用不得不严格控制剂量，但剂量的控制又使得疗效得不到提高，严重影响临床疗效。

生熟大黄药对为国医大师刘尚义教授临床针对肾损伤的常用药对，在前期的临床研究中发现生熟大黄对铂类药物所致肾损伤的病人具有一定的改善作用。因此本研究希望通过动物实验证明生熟大黄具有改善顺铂所致肾损伤的作用，初步了解其作用机制，并为临床运用提供证据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

采用6～8周龄雄性清洁级BALB/c近交系小鼠40只，体质量(18±2)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2018-014。适应性喂养1周，随机分为生熟大黄高、中、低剂量组及模型对照组、空白对照组，每组8只。

1.2 实验用药

生熟大黄水煎液：由生大黄6 g、熟大黄6 g组成。由贵州中医药大学第一附属医院药剂科安全用药规定(折合成小鼠剂量)熬制成60 mg生药/mL、120 mg生药/mL及240 mg生药/mL 3种浓度的药汁，100 mL真空包装，4 ℃冰箱保存备用。顺铂由贵州中医药大学第一附属医院西药房提供，规格为10 mg/瓶，齐鲁制药有限公司，国药准字：H20073652，批号：AA1A8036A。

1.3 模型制备及给药

分别给模型对照组，生熟大黄高、中、低剂量组，每组每只小鼠以顺铂4 mg/kg单次腹腔注射制作肾损伤模型[2]，空白对照组不予处理，给药5天(前期实验中发现顺铂给药5天后小鼠出现尿素、肌酐及胱抑素C的升高，且肾小管多灶状萎缩伴部分肾小管代偿肥大，提示肾损伤模型造模成功)。生熟大黄高、中、低剂量组分别给予240 mg/mL、120 mg/mL及60 mg/mL浓度的生熟大黄水煎液灌胃，模型对照组给予0.13 mL/10 g/d蒸馏水灌胃；空白组不作任何处理；隔日称体重1次，并根据体重变化调整灌胃剂量[2]。

1.4 观察指标

1.4.1 小鼠血清BUN、SCR、胱抑素C的含量 生熟大黄水煎液灌胃2周后，禁食24 h后称体重，摘眼球法取血[2]，用离心管迅速接血，常温静置1 h后，离心，ELISA检测小鼠血清尿素氮、肌酐及胱抑素C的含量。

1.4.2 小鼠肾脏系数及肾脏病理切片 取出双侧肾脏称重并计算肾脏系数；将其中一侧肾固定于4%多聚甲醛中[2]，进行常规石蜡包埋、切片及HE染色，染色成功后于400倍光学显微镜下观察肾小管上皮细胞、集合管上皮细胞及周围炎性细胞浸润情况和形态变化。

1.5 统计学方法

2.1 各组小鼠肾脏系数比较

模型对照组肾脏系数显著上升，与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；生熟大黄各剂量组与模型对照组比较肾脏系数均降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而各生熟大黄干预组之间比较，差异无统计学意义。

表1 各组小鼠肾脏系数比较

2.2 各组小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C含量变化

模型对照组与空白对照组比较，其BUN、SCR和胱抑素C均明显升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；生熟大黄各剂量组与空白对照组比较，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)，生熟大黄各剂量组与模型对照组比较，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度下降，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C比较

2.3 各组小鼠肾脏HE染色病理切片情况

空白组：肾组织结构正常，肾小管形态正常，且各结构间界限清晰。模型对照组：肾小管上皮细胞内出现大小不等的空泡伴上皮细胞脱落、坏死，基底膜不规则，见不均匀的皱缩及增厚现象，间质中有大量炎性细胞浸润，小管内可见蛋白管型。3组生熟大黄治疗组：肾小管上皮细胞空泡减少，基底膜增厚及皱缩情况得以改善，间质炎性细胞浸润明显减轻。见图1。

图1 肾组织病理特征(HE，×400)

3 讨论

顺铂引起肾损伤，其主要表现为血中尿素氮、肌酐升高以及尿中出现透明管型等现象。顺铂所致肾损伤其作用靶位主要在肾小管，对近曲小管和集合小管的损伤尤为突出，其在病理表现为肾小管上皮细胞急性变性、坏死，间质水肿，小管扩张等。顺铂的肾损伤早期一般都是可逆的，但随着药物剂量的蓄积，亦可导致肾脏不可逆性损伤，严重时导致患者肾衰竭或者死亡。

随着中医药的不断发展，现代中医学者对中药干预顺铂所致肾损伤的研究方面取得重大进展，中医药在肿瘤患者化疗中的增效减毒功效日益显著。如有些中医学者根据中医理论：肾为先天之本，脾为后天之本，以“渗水利湿，温阳化气”为法则选用排毒利尿的五苓散治疗顺铂所致的肾损伤取得了一定疗效[3]。有学者以“清热滋阴”为法，选用加味黄连阿胶汤干预顺铂所致的肾损伤，并通过动物实验证实其疗效[4]。另有学者采用益肾排毒之法进行干预，同时进行实验证明其疗效[5]。还有大量的中医运用于此，诸如健脾养正消癥[6]、益肾养肝[7]、补肾滋阴[8]等，均取得很好的临床疗效。除复方研究外，现代中医学者对单药也做了诸多研究，如利用黄芪[9-13]的提取物进行了大量的体外实验，证实了其疗效。除黄芪以外，灵芝[14]、冬虫夏草[15-16]等对顺铂所致肾损伤的保护作用也都得到证实。

现代中医将“化疗药-顺铂”归属于“外邪”，外来之“药毒”“邪毒”，虽治疗恶性肿瘤，但加重了热毒内蕴的症状，从而导致瘀毒互结。“清热解毒化瘀”乃当务之急，选用生熟大黄水煎液清热泻火、凉血解毒、逐瘀。且现代医学研究发现生熟大黄水煎液有效成分的药理作用研究主要集中在蒽醌类化合物，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等[17]，其对胃肠道、肝肾及心肌均具有保护作用，同时具有改善循环、抗肿瘤等作用。

本实验发现，生熟大黄水煎液能降低小鼠肾脏系数及小鼠体内血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，同时改善小鼠肾小管损伤，提示生熟大黄水煎液对小鼠顺铂所致的肾损伤具有一定的改善作用，但其具体分子机制仍有待进一步深入研究。