HPLC法同时测定鸡眼草中6种主要有效成分含量

陈桂江，刘晓霖，王新雨

(1.广东省实验动物监测所，广东 广州510663；2.广东岭南职业技术学院， 广东 广州 510663；3.广东罗浮山国药股份有限公司，广东 惠州 516133)

鸡眼草为豆科植物鸡眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindi.的干燥全草，始载于《救荒本草》，又名掐不齐、人字草、三叶人字草等，分布广泛，资源丰富。其味微苦，性凉，为民间用药，具有凉血解毒、清热解表、散瘀消积等功效[1-2]，主治胃肠炎、痢疾、肝炎、夜盲症、泌尿系统感染等[3-6]。现代药理学研究[7]表明，鸡眼草具有抗炎、抗病毒、杀菌、抗肿瘤作用等。其主要含有黄酮类成分，另外含有氨基酸、多糖、多酚等[8]，其中异荭草苷具有多种药理活性，如抗氧化、抑制炎症发展、改善胰岛素抵抗、弱化肝纤维化发展以及诱导肝癌细胞凋亡等作用[9]，木犀草素、木犀草苷具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多种药理作用[10-11]，染料木苷及染料木素具有改善女性更年期综合征、抗肿瘤、改善心肌缺血、调节代谢综合征、抗炎和细胞保护等药理活性[12-13]。因此，该药材具有重要的开发价值。

目前，有关鸡眼草含量测定的文献报道较少，且测定成分较为单一[14-15]，不能较全面地反映药材的内在质量。为了建立一种既能比较完善表达鸡眼草的整体性特征，又有别于化学药单一成分定量的质量控制模式，本文采用HPLC法对鸡眼草中异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素6种主要有效成分同时进行检测，比较根、茎、叶中该6种主要有效成分含量的高低。该方法可为鸡眼草质量的综合评价及临床使用提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

安捷伦1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，包含DAD检测器、柱温箱、四元泵、自动进样器、OpenLAB CDS色谱工作站；SHZ-IIIA循环水多用真空泵(西安莫吉娜仪器制造公司)；KQ-300DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。Milli-Q纯水仪(德国密理博公司)；ThermoStable SOV-20真空干燥箱(韩国大韩公司)。

1.2 试剂与药材

甲醇(批号I0890607719，默克HPLC级)；甲酸(批号C10106313，麦克林HPLC级)；异荭草素标准品(批号M74818074，纯度≥98%，麦克林)；异牡荆素标准品(批号20160706，纯度≥98%，宝鸡辰光生物)；染料木苷(纯度≥98%，上海中药标准化研究中心)；木犀草苷(批号16052307，纯度≥98%，成都普菲德生物技术有限公司)；染料木素(批号HG031193198，纯度≥98%，宝鸡辰光生物技术有限公司)；木犀草素(批号HL0906100198，纯度≥98%，宝鸡辰光生物技术有限公司)。药材购买于广东省揭阳，经广东岭南职业技术学院许友毅副教授鉴定该药材为豆科植物鸡眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindi.的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent SB-AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱。流动相：0.1%甲酸(A)，0.1%甲酸甲醇溶液(B)，洗脱梯度：0～20 min，64% A；20～35 min，64%～69% A；35～40 min，69%～67% A；40～50 min，67% A；50～60 min，67%～47% A；60～70 min，47%～40% A；70～80 min，40%～30% A。流速：0.8 mL/min，柱温：25 ℃，检测波长：260 nm、350 nm，进样量：10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品储备液 分别精密称取异荭草素对照品10 mg、异牡荆素对照品10 mg、染料木苷对照品10 mg、木犀草苷对照品10 mg、染料木素对照品10 mg、木犀草素对照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用适量甲醇溶解，70%甲醇溶液稀释、定容成1 mg/mL的对照品储备液。分别精密量取上述溶液2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，配制成0.1 mg/mL的混合对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液 取鸡眼草约1 g，精密称定，加70%甲醇溶液50 mL，浸泡60 min，超声60 min。提取液于50 ℃真空减压干燥箱浓缩，用甲醇定容至10 mL。

2.2.3 空白溶液 取70%甲醇溶液作为空白溶液。

2.3 专属性试验

取空白溶液、35 μg/mL混合对照品溶液、鸡眼草(全草)溶液10 μL，分别进样得色谱图。结果表明，空白溶液在对照品溶液相对应的位置上没有出现色谱峰，表明空白溶液无干扰，结果见图1。

2.4 线性关系考察、检测限和定量限

取“2.2.1”项下的混合对照品储备液作为1 000 μg/mL的标准曲线溶液，分别精密量取“2.2.1”项下对照品储备液2.5、1、0.5、0.25、0.05、0.025 mL，置于5 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度；分别精密量取“2.2.1”项下对照品储备液0.25、0.05、0.025 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度；将上述所有溶液作为系列浓度的混合对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件分析，记录峰面积积分，以峰面积积分(Y)为纵坐标，对照品质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，进行线性回归。结果见表1。

1.异荭草素；2.异牡荆素；3.染料木苷；4.木犀草苷；5.染料木素；6.木犀草素

取100 μg/mL对照品混合溶液，置于容量瓶中，用70%甲醇溶液稀释定容，以S/N值≥3为检测限，S/N值≥10为定量限。结果见表1。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液0.25 mL，置于5 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，同法配制6份溶液，按上述色谱条件进样，测定其峰面积，计算RSD值。结果表明，异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素峰面积积分RSD分别为0.10%、0.11%、1.49%、0.32%、0.09%、0.01%，表明试验方法精密度良好。

2.6 重复性试验

取同批号的6份鸡眼草(全草)，按照“2.2.2”项下方法，制备鸡眼草溶液，按相应色谱条件进样，测定其峰面积积分，计算RSD值。结果表明，异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素峰面积积分RSD分别为3.61%、1.61%、1.17%、1.24%、2.91%、2.80%，表明试验方法精密度良好。

2.7 加样回收率试验

取已测6种有效成分含量的鸡眼草约1 g，精密称定，按高、中、低浓度分别加入一定量的对照品，按照“2.2.2”项下操作，制备成加样回收率供试液，并依法测定，结果见表2。

表1 标准曲线和检测限、定量限 (n=3)

表2 鸡眼草中6种主要有效成分的加样回收率试验结果 (n=3)

续表2

异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素在高、中、低浓度下的回收率均在95%～105%范围内，表明分析方法符合要求。

2.8 稳定性实验

取全草供试品溶液，分别于放置0、3、6、9、12、15、24 h后按照上述色谱条件进样，测定其峰面积积分，计算RSD值。结果表明，异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素峰面积积分RSD分别为0.17%、0.12%、1.37%、0.33%、0.14%、0.15%，表明样品溶液在试验条件下24 h内稳定。

2.9 样品含量测定

分别取同一批号的鸡眼草全草、根、茎、叶约1 g，精密称定，按照“2.2.2”项下方法制备样品溶液，各平行制备6份，分别测定异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素的含量，结果见表3。

表3 样品中6种有效成分含量测定结果

结果表明，异红草素、异牡荆素、木犀草苷、木犀草素在叶片中含量最高，茎次之，根中含量最低；染料木苷在茎中含量较高，根次之，叶片中几乎未能检测到。染料木素在根中含量最高，茎次之，叶片中几乎未能检测到。

3 讨论

3.1 检测成分的选择

鸡眼草中含有荭草素、异荭草素、染料木苷、异牡荆素、木犀草苷、染料木素、木犀草素、槲皮素、芦丁、山奈酚、芹菜素等多种有效成分[16-17]。本研究发现，鸡眼草中荭草素含量较低，且在该实验中分离度不好，因此，未对其进行定量。此外，该研究中未检测到山奈酚、芹菜素、槲皮素和芦丁。在该试验条件下，木犀草素和槲皮素出峰时间相同，但二者的最大吸收波长不同，槲皮素的最佳吸收波长为374 nm、254 nm，而木犀草素为350 nm、254 nm，通过观察3D图谱可知，样品中含有的是木犀草素，而不是槲皮素。因此，本研究对异荭草素、染料木苷、异牡荆素、木犀草苷、染料木素、木犀草素6种成分进行了定量。

3.2 提取条件的优化

处理样品时，比较了50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇的提取效果。发现50%甲醇与70%甲醇的提取物杂质峰较多；甲醇与乙醇提取时，杂质峰较少，但是乙醇提取时，异荭草素及异牡荆素的峰面积相对减少，最终选择了甲醇作为提取溶剂。在制备供试品溶液时，考察了连续回流提取法和超声提取法的提取效果，结果表明两种提取方法对该6种成分峰面积无明显影响，但是超声提取操作简便，因此选择超声提取法制备供试品溶液。超声提取制备供试品溶液时，考察了超声时间30 min、60 min、90 min的提取效果，结果表明超声提取30 min时，各峰的峰面积均较小；超声提取60 min与90 min时，各成分的峰面积无显著差异，因此，选择了超声提取60 min制备供试品溶液。

3.3 色谱条件的选择

异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素6种成分均为黄酮类化合物，对6种成分在200～400 nm波长范围内扫描，染料木苷和染料木素的最佳吸收波长为260 nm，异荭草素、异牡荆素、染料木苷、木犀草苷、木犀草素的最佳吸收波长350 nm，且各吸收峰的峰面积、峰形及分离度等指标较为理想，故选定260 nm和350 nm进行双波长检测。对中药复方制剂多指标组分进行同时测定，流动相体系的筛选尤为关键，根据所测指标性成分的理化性质和色谱行为，比较了以甲醇-水、甲醇-0.5%甲酸溶液、乙腈-0.5%甲酸溶液、0.1%甲酸-0.1%甲酸甲醇溶液为流动相，分别进行梯度洗脱的效果。采用乙腈-0.5%甲酸作为流动相梯度洗脱时，异牡荆素、木犀草苷重叠为一个峰，难以分开。采用0.1%甲酸-0.1%甲酸甲醇溶液作为流动相梯度洗脱时，可将二者分开，分离度达到要求，其余4种成分色谱峰的分离度和理论塔板数也均能达到要求。

4 结论

本研究采用HPLC同时测定鸡眼草中6种主要有效成分的含量，该方法灵敏度高、专属性强，所用流动相系统和预处理方法简便，能较好地控制鸡眼草的质量。该6种成分在鸡眼草根、茎、叶、全草的不同药用部位中含量差异较大，异荭草素、异牡荆素、木犀草素在叶中含量较高，染料木苷在茎中含量较高，染料木素在根中含量较高，并且叶中未能检测到染料木苷、染料木素，该结果可为鸡眼草的炮制及临床用药提供参考依据。