槐角配方颗粒质量标准研究

张彩虹，余志芳，班朝旭，陈 蓉，张 晨，张开元，黄美华，胡昌江

(四川新绿色药业科技发展有限公司 国家中医药管理局 “中药配方颗粒质量与疗效评价”重点研究室，四川 成都 611900)

槐角为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥成熟果实，具有清热泻火、凉血止血的功效，主要用于治疗肠热便血、痔肿出血、肝热头痛、眩晕目赤等证[1]。槐角为我国传统中药，临床应用广泛，水煎汤剂作为槐角的传统应用形式，存在服药量大、利用率低、煎煮时间长等问题[2-3]。槐角配方颗粒是用符合炮制规范的传统槐角饮片作为原料，经现代制药技术提取、浓缩、分离、干燥、制粒、包装精致而成的纯中药颗粒剂，具有不用煎煮、容易调配、方便携带、一冲即服的特点[4-5]。但将中药饮片制成中药配方颗粒后失去了原饮片的性状鉴别特征，中药配方颗粒也存在对其疗效认识不足、缺乏统一标准、基础研究薄弱等问题[6-7]。为了控制中药配方颗粒质量，本研究采用薄层色谱法和高效液相色谱法建立了以对照药材为随行对照的特征图谱和薄层鉴别，对槐角配方颗粒进行了多成分、全面的定性鉴别，为健全槐角配方颗粒质量控制评价体系提供技术支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪：岛津LC-20AD型高效液相色谱仪、Agilent1200型高效液相色谱仪、Agilent1260型高效液相色谱仪；电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；超声波清洗器：KQ5200DB型(600 W，40 kHz；昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅：DZKW-4型(北京中兴伟业仪器有限公司)。

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18250×4.6 mm、phenomenex Luna 5 μm C18(2)100A 4.6×250 mm、Inertsustain C185 μm 4.6×250 mm、Waters XBridge C185 μm 4.6×250 mm；半自动薄层点样仪：CAMAG Lionmat-5；薄层成像系统：CAMAG TLC Visualizer；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂，天津思利达科技有限公司)。

1.2 试剂及材料

乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。槐角苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111695-201703，含量以99.6%计)；芦丁对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18012501)；槐角对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121214-201512)。槐角配方颗粒(批号：SY1806001、SY1806002、SY1806003，四川新绿色药业科技发展有限公司)。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 薄层鉴别方法 取本品，研细，取约1 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇10 mL使溶解，作为供试品溶液。取槐角对照药材0.5 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。另取槐角苷对照品与芦丁对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，分别吸取上述溶液3 μL、0.5 μL、5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.1.2 方法学考察 专属性考察：按照拟定的薄层鉴别方法，制备缺槐角配方颗粒的空白对照溶液、槐角苷对照品溶液、芦丁对照品溶液、槐角对照药材溶液、供试品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯下365 nm下检视。结果显示，空白溶剂对色谱鉴别无干扰，供试品色谱中在与对照品色谱、对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，说明该方法专属性好。见图1。

注：从左至右依次为空白对照；槐角苷对照品；芦丁对照品；槐角对照药材；槐角配方颗粒(SY1806001)

点样量考察：按照拟定的薄层鉴别方法，取对照品溶液5 μL、对照药材溶液0.5 μL，供试品溶液3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯下365 nm下检视。由供试品溶液不同点样量的薄层色谱图可知，点样3 μL时主斑点较清晰，且分离度较好，故确定本品供试品溶液的点样量为3 μL。见图2。

注：从左至右依次为槐角苷对照品；芦丁对照品；槐角对照药材；槐角配方颗粒(SY1806001)3 μL；槐角配方颗粒(SY1806001)4 μL；槐角配方颗粒(SY1806001)5 μL；槐角配方颗粒(SY1806001)6 μL；槐角配方颗粒(SY1806001)7 μL。

耐用性考察：不同薄层板比较：选取青岛海洋化工厂分厂预制硅胶G板、天津思利达科技有限公司可剪裁型薄层层析板(硅胶G板)，分别按拟定的试验方法试验。分析比较不同薄层板展开的薄层色谱图，结果表明在已选定的薄层色谱条件下，不同薄层板均能达到鉴别目的。见图3、图4。

图3 青岛海洋硅胶G板下薄层色谱

注：从左至右依次为槐角苷对照品；芦丁对照品；槐角对照药材；槐角配方颗粒(SY1806001)

不同温度比较：取点样后的薄层板，分别在低温8 ℃和常温25 ℃的温度环境下进行展开。结果表明，在8 ℃和25 ℃环境中展开的薄层色谱图各主斑点清晰，且分离度较好；均可达到鉴别目的，故该薄层鉴别方法在8～25 ℃耐用性良好。见图5、图6。

图5 8 ℃下薄层色谱

注：从左至右依次为槐角苷对照品；芦丁对照品；槐角对照药材；槐角配方颗粒(SY1806001)

不同湿度比较：取点样后的薄层板，分别在32%和75%的湿度环境下进行展开。结果表明该方法对不同湿度的适应性较好。见图7、图8。

图7 32%湿度下色谱

注：从左至右依次为槐角苷对照品；芦丁对照品；槐角对照药材；槐角配方颗粒(SY1806001)

由图7、图8可知，该薄层展开在相对湿度32%和75%环境中主斑点清晰，分离度好，表明该方法在相对湿度32%～75%环境中耐用性良好。

2.1.3 方法验证 按上述方法分别对多批槐角配方颗粒样品进行薄层鉴别。实验结果表明，上述薄层鉴别方法能够对槐角配方颗粒成品进行有效鉴别，耐用性良好，可用于槐角配方颗粒的质量标准研究。见图9。

注：从左往右依次为：混合对照品(槐角苷(上)、芦丁(下))；槐角对照药材；槐角配方颗粒SY1806001；槐角配方颗粒SY1806002；槐角配方颗粒SY1806003。

2.2 特征图谱

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250 mm，内径为4.6 mm，粒度为5 μm)以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按“表1”中的规定进行梯度洗脱；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；检测波长为282 nm。理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3 000。

表1 流动相梯度

2.2.2 参照物溶液的制备 取槐角对照药材0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，密塞，超声处理(功率600 W，频率40 kHz)20 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品参照物溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取槐角配方颗粒研细，取约0.1 g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，密塞，超声处理(功率600 W，频率40 kHz)20 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 方法学考察 色谱峰指认：供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备槐角配方颗粒供试品溶液。

对照品参照物溶液的制备：取槐角苷、芦丁对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL各含0.2 mg的溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺槐角配方颗粒阴性对照溶液。对槐角配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图10。

图10 槐角配方颗粒特征图谱色谱峰指认

结果表明，峰8为芦丁，峰12为槐角苷。在以下方法学考察中，对样品图谱中的12个峰进行考察。

精密度试验：取槐角配方颗粒(批号：SY1806001)约0.1 g，按拟定实验方法进行制备及测定，连续进样6次，每次10 μL，进行测定。结果见表2、表3。

表2 精密度-特征峰相对保留时间

表3 精密度-特征峰相对峰面积

结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01%～0.07%，各特征峰相对峰面积的RSD在0.15%～0.55%，说明该仪器精密度良好。

重复性考察：取槐角配方颗粒(批号：SY1806001)约0.1 g，称定6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表4、表5。

表4 重复性考察-特征峰相对保留时间比值

表5 重复性考察-特征峰相对峰面积比值

结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01%～0.15%，各特征峰相对峰面积的RSD在0.50%～1.03%，说明该仪器重复性良好。

中间精密度考察：不同制备人员和不同制备时间考察：在以上拟定的实验条件基础上，分别在不同人员(A、B)和不同时间(T1 、T2)条件下精密称取槐角配方颗粒(批号：SY1806001)约0.1 g，按拟定实验方法进行制备及测定。结果见表6、表7。

表6 不同人员与时间考察-特征峰相对保留时间比值

表7 不同人员与时间考察-特征峰相对峰面积比值

结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01%～0.09%，各特征峰相对峰面积的RSD在0.15%～1.78%，说明该方法适用性较好。

不同仪器考察：在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取槐角配方颗粒(批号：SY1806001)两份，制备供试品溶液，分别在岛津LC-2040C、岛津LC-30AD、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定。计算所得结果，见表8、表9和图11。

表8 不同仪器考察-特征峰相对保留时间比值

表9 不同仪器考察-特征峰相对峰面积比值

图11 不同仪器考察

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.21%～1.72%，各特征峰相对峰面积的RSD为2.09%～29.70%。

耐用性考察：色谱柱耐用性考察：在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Agilent TC-C18250 mm×4.6 mm、Inertsustain C185 μm 4.6 mm×250 mm、Waters XBridge C185 μm 4.6 mm×250 mm进行考察。见图12和表10、表11。

图12 槐角配方颗粒色谱柱耐用性考察

表10 色谱柱耐用性考察-特征峰相对保留时间

表11 色谱柱耐用性考察-特征峰相对峰面积比值

结果表明，由表10、表11可知，用上述3种色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.17%～5.60%，各特征峰相对峰面积的RSD为5.74%～53.83%，说明本方法具有适用性。由图31可知，Agilent TC-C18色谱柱分离度较差，其将峰4和峰5合并为了一个峰，Waters XBridge C18色谱柱可以将12个特征峰分离出来，Waters XBridge C18色谱柱和Inertsustain C18色谱柱峰1和峰2错位，不利于特征峰的鉴定。Inertsustain C18色谱柱可以将12个特征峰有效分离，且色谱信息丰富，故该特征图谱方法推荐使用Inertsustain C18色谱柱。

24 h稳定性考察：在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0 h、2 h、6 h、10 h、16 h、24 h测定。见表12、表13。

表12 24 h稳定性考察-特征峰保留时间

表13 24 h稳定性考察-特征峰峰面积比值

结果表明，其相对应的特征峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.12%，特征峰相对峰面积的RSD为0.30%～2.64%，说明样品溶液在24 h内较稳定。

2.2.5 测定 采用拟定的方法分别对3批槐角配方颗粒进行测定，计算相对保留时间和相对峰面积。见图13和表14、表15。

图13 槐角配方颗粒特征图谱

表14 3批槐角配方颗粒相对保留时间

由图13、表14、表15可知，该特征图谱方法能够对槐角配方颗粒进行有效检测，故该方法可用于槐角配方颗粒的研究。

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了12个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，3批次槐角配方颗粒各特征峰相对峰面积RSD差异太大，因此不纳入质量标准研究。3批次槐角配方颗粒12个特征峰相对保留时间RSD均小于1.0%。最终规定：供试品特征图谱中应呈现12个特征峰，与芦丁参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为：0.34(峰1)、0.35(峰2)、0.68(峰3)、0.70(峰4)、0.71(峰5)、0.84(峰6)、0.95(峰7)、1.00(峰8，S)、1.17(峰9)、1.22(峰10)、1.36(峰11)、1.41(峰12)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批次槐角配方颗粒进行合成，建立了槐角配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图14。

注：峰(8，S)：芦丁

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别方法

《中国药典》2015年版一部“槐角”项下无薄层色谱鉴别，只规定按照“含量测定”项下的方法试验，供试品色谱中应呈现出与对照品色谱峰保留时间相一致的色谱峰，该方法仅能鉴定槐角中槐角苷单一成分，信息不够全面[1]。现代研究表明黄酮及异黄酮类化合物是槐角的主要有效成分，槐角苷为槐角异黄酮类化合物的代表性成分，芦丁为槐角黄酮类化合物的代表性成分，两者具有降血压、抗生育和抗癌作用，能较好地防治骨质疏松[8]。本实验采用槐角苷、芦丁和槐角对照药材同时作为槐角配方颗粒薄层鉴别的对照，使方法具有科学性，色谱信息更具全面性。

展开剂是薄层色谱鉴别的关键影响因素，为了获得较好的分离效果，本实验考察了两种展开系统，分别为乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)和乙酸乙酯-甲酸-甲醇(8∶2∶1)，结果显示在展开系统乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)条件下，对照品、对照药材、供试品斑点清晰、色谱信息量大、分离度好、Rf值适当。

另外，本实验还考察了甲醇和水作提取溶媒，回流和超声两种提取方法，最终确定供试品制备方法为：以甲醇为溶剂，超声提取。薄层色谱方法学考察结果显示槐角配方颗粒薄层鉴别方法，具有斑点清晰、承载信息量大、专属性强、操作简便等优点，可用于槐角配方颗粒质量标准研究。

3.2 特征图谱方法的建立

在质量控制评价方面，现行的中药配方颗粒质量标准多采用对某有效成分进行含量测定，而中药是多成分的整体作用，且由于中药配方颗粒是经过多工序加工而成，失去原有饮片的形态，在质量控制上缺少饮片性状等重要指标，仅靠某有效成分的含量测定无法全面反映配方颗粒质量效果，因此在质量控制标准制定中必须加强专属性鉴别和整体性质量控制[9-10]。本研究前期对提取溶剂(50%甲醇，70%甲醇，水)、提取方法(回流，超声)、提取时间(20 min，30 min，40 min)等进行了考察。结果表明，在相同的色谱条件下，50%甲醇超声提取20 min制备的供试品，色谱峰信息量大、分离度好。特征图谱方法学结果显示该方法操作简便，稳定性及重现性良好，能较全面地反映槐角配方颗粒的化学成分系统，可为槐角配方颗粒的整体质量评价提供技术支撑。