淫羊藿苷防治股骨头坏死分子机制研究进展

章晓云 李华南 陈跃平

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004 2.广西中医药大学附属瑞康医院骨科，广西 南宁 530011 3.江西中医药大学附属医院骨伤三科，江西 南昌 330006

中医学认为肾主骨生髓，肾气充足则骨骼得以生长、修复，肾气虚则骨痿，而股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)在古时称之为“骨蚀、骨痿、骨痹”。目前以肾主骨理念为指导进行中医药治疗股骨头坏死的研究中，淫羊藿是研究比较成熟的中药之一。淫羊藿始载于《神农本草经》，列为中品，认为其“味辛，寒。主阴痿绝伤，茎中痛，利小便益气力，强志”，《本草经集注》补充提出：“其可坚筋骨，消瘰疬，赤痈”。现代医学研究[1-3]表明淫羊藿治疗ONFH效果明显，主要通过影响Wnt、RANK/RANKL、PI3K-Akt、Notch、MAPK、TGF-β、HIF-1、FoxO等信号通路发挥治疗ONFH的作用。中药药理研究表明淫羊藿苷(Icariin，ICA)是其主要药效成分，可有效改善骨代谢平衡，增强骨密度与强度[4]，现将ICA治疗ONFH的分子机制研究综述如下。

1 ICA通过经典Wnt/β-catenin促进成骨细胞增殖分化

Wnt信号通路可调节成骨细胞、肿瘤细胞、肾脏细胞等多种细胞的分化、增殖、迁移。Wnt信号通路主要有经典Wnt/钙离子、Wnt/PCP与Wnt/β-catenin 3种信号通路，其中Wnt/β-catenin信号通路为经典通路。Wnt蛋白与存在于细胞表面的Frizzled家族蛋白受体、低密度脂蛋白受体关联蛋白LRP6及LRP5进行结合后从而激活Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制axin、GSK-3、APC蛋白对β-catenin蛋白的降解作用，使β-catenin在细胞质内的含量得以稳定，并最终与核内转录因子(TCF/LEF)结合促进下游特定基因的表达，这是参与调节细胞增殖分化的主要路径。Wnt/β-catenin信号通路可调节成骨细胞与破骨细胞增殖分化，在骨生成与代谢过程中扮演着非常重要的角色。因此，寻找激活Wnt信号通路以调节成骨细胞与破骨细胞之间骨代谢平衡的方法成为治疗股骨头坏死的关键。随着对淫羊藿研究的不断深入后发现其主要药效成分ICA可以通过刺激经典Wnt/β-catenin信号通路从而达到刺激成骨细胞增殖分化，并抑制破骨细胞形成的效果，其可改善骨代谢平衡，抑制股骨头坏死的进一步发展。Wang等[5]研究表明ICA可激活Wnt信号通路，提高成骨细胞增殖分化所需的相关因子β-catenin、Runx2、cyclinD 1和ALP的表达水平，从而促进成骨细胞分化。Liu等[6]在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)损伤模型中加入ICA后发现其增强了暴露于超负荷状态下成骨细胞的增殖，促进了MC3T3-E1细胞分化和矿化，其中ALP、β-catenin和Runx 2的基因和蛋白表达水平与实验对照组相比均有提高。这说明ICA可通过提高β-catenin在胞内的表达水平，从而激活Wnt/β-catenin信号通路的表达，进一步促进β-catenin与TCF/LEF结合。另外，ICA可提高成骨分化相关基因蛋白的表达，最终促进成骨细胞增殖分化(图1)。由此可见ICA可通过经典Wnt/β-catenin促进成骨细胞增殖分化。

图1 ICA通过经典Wnt/β-catenin促进成骨细胞增殖分化机制Fig.1 Mechanism of icariin promoting osteoblast proliferation and differentiation through Wnt/β-Catenin

2 ICA介导RANK/RANKL信号通路抑制破骨细胞分化

破骨细胞由多核巨细胞组成，促进骨吸收为其主要功能，这使它在骨的生长发育、修复代谢中发挥着重要作用，但过快的破骨细胞增殖分化会引起骨质被过度吸收，使股骨头区域的骨代谢平衡被打破从而引起股骨头局部出现骨塌陷。破骨细胞的增殖、分化及发育主要与两种细胞因子有关，即巨噬细胞刺激集落因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)与NF-κB配体受体活化因子(receptor activator of NF-κβ，RANK)。当RANK与破骨细胞前体表面的受体RANKL相结合后，会进一步与衔接分子TRAF6相互作用，而TRAF6作为MAPK、NF-κB以及一些破骨细胞相关基因的催化细胞因子，可激活MAPK、NF-κB信号通路促进破骨细胞形成与分化，因此阻止RANK与RANKL结合是抑制破骨细胞分化的方式之一。Kim等[1]研究表明ICA抑制破骨细胞不仅可以通过OPG/RANK/RANKL信号通路，还可以通过调节RANKL介导的TRAF6/NF-κB/ERK信号通路来抑制破骨细胞的形成。TRAF6是RANK/RANKL在早期吸引而来的细胞分子，被视为破骨细胞增殖分化的主要标志物。当TRAF6含量受到明显抑制时，则会出现破骨细胞分化缓慢，成熟破骨细胞形成有关的NF-κB蛋白表达受到抑制，而该蛋白恰好是RANK/RANKL途径的重要下游靶标。目前发现骨保护素(osteoprotegerin，OPG)可抑制RANK/RANKL信号通路的表达，它通过与RANKL相结合，阻断RANK与RANKL的结合，从而减少破骨细胞分化，提高骨量，并且RANKL/OPG比值被视为衡量骨量的重要指标之一[7]。Sun等[8]研究表明ICA可提高成骨相关基因ALP，BGP及OPG/RANKL的表达水平促进成骨分化，同时降低骨吸收标志物TRACP-5b水平抑制骨吸收，从而维持骨代谢平稳。吴峻等[9]研究表明ICA通过提高OPG的水平，降低RANKL及RANK的表达水平，从而提高血清中BGP、ALP及Ca2+的水平，最终抑制成骨细胞凋亡。OPG作为成骨细胞分泌的一种细胞因子，当ICA促进成骨细胞增殖分化时，其OPG的分泌也将随之增多，这对抑制破骨细胞分化有着非常积极的作用。由此可见，ICA可通过抑制RANK/RANKL信号通路及其下游相关靶基因抑制破骨细胞的分化，见图2。

图2 ICA介导RANK/RANKL信号通路抑制破骨细胞分化机制Fig.2 Mechanism of icariin-mediated RANK/RANKL signaling pathway inhibiting osteoclast differentiation

3 ICA通过刺激DEC1与PI3K/AKT信号通路调节骨代谢

人分化的胚胎软骨细胞表达基因1(differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1，DEC1)是基本螺旋-环-螺旋蛋白的一种。它参与机体多种生理过程，包括生理节律性、生理代谢的动态平衡与细胞增殖、分化和凋亡。研究[10]发现DEC1的表达水平与BMSCs中成骨细胞的表达密切相关，DEC1的过表达会加速BMSCs向软骨分化，相反DEC1的低表达会抑制BMSCs的成骨分化。另一篇报道[11]中发现DEC1在生长期软骨细胞中的过度表达会增加Runx2和X型胶原的mRNA水平，并使ALP活性提高，从而促进成骨细胞分化及细胞矿化，这说明DEC1可通过某种信号通路表达调控成骨分化。虽然目前这种机制尚未被证实，但是仍可寻找相关药物介导DEC1的表达水平调控成骨细胞的分化。研究证实[12-13]地塞米松可显著降低DEC1表达水平，而ICA作用相反。Hu等[14]研究表明ICA可提高DEC1表达水平，并且可逆转因地塞米松引起的DEC1低表达，这种改变主要依赖药物浓度，研究还证实了DEC1可促进成骨分化，并认为ICA可作用PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路参与诱导的成骨过程，促进成骨分化。PI3K信号通路可通过激活下游靶基因蛋白参与多种细胞增殖分化凋亡及葡萄糖转运，其中AKT是PI3K通路中的一种关键激酶，它与PI3K结合可构建成多种信号的中心网络。有研究认为PI3K/AKT信号通路可通过激活下游细胞因子如HIF-1α、BMPs、GSK-3β等以促进血管修复、调节骨代谢平衡，对治疗股骨头坏死具有非常重要的意义[15]。其中GSK-3β不仅在Wnt/β-catenin信号中扮演着重要角色，而且当GSK-3β受到激活后出现磷酸化可抑制β-catenin的降解，提高β-catenin在胞质内的浓度，并与下游成骨细胞核内靶基因cyclin D1与c-myc相结合，从而加速破骨细胞凋亡及成骨细胞增殖分化[16-18]。GSK-3β还可通过抑制NFATc 1与DNA结合的能力，从而抑制破骨分化[19]。由此可见，ICA通过提高体内PI3K、β-catenin、GSK-3β基因的表达水平从而对股骨头坏死血管损伤的修复以及骨代谢平衡的维持具有非常积极的作用。ICA不仅可单独通过提升DEC1的表达水平促进成骨分化，还可刺激PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin的表达促进修复血管，恢复血供，调节骨代谢平衡，这为股骨头坏死的治疗提供了一种潜在的方法(见图3)。

图3 ICA通过刺激DEC1与PI3K/AKT信号通路调节骨代谢分子机制Fig.3 Molecular mechanism of icariin regulating bone metabolism by stimulating DEC1 and PI3K/Akt signaling pathway

4 ICA通过抑制Notch信号促进成骨分化

Notch基因最早由托马斯于1917年研究果蝇翅膀边缘切迹原因时发现，而该基因形成的信号通路是一条涉及机体几乎所有细胞增殖分化活动的信号转导通路，并在调节细胞生理及病理过程中起重要作用。该信号通路主要由Notch受体及其配体(DSL蛋白与CSL蛋白)、Notch调节因子及其他效应物组成。当该受体与配体结合后会在Notch跨膜区胞外端的s1、s2、s3位点分别被furin蛋白酶、ADAM家族的肿瘤坏死因子-α-转换酶或kuzbanian(Kuz)、早老素(PS)进行3次酶切，形成可溶性NICD并转移至核内与CSL蛋白结合，最终与DNA形成多蛋白-DNA复合体，可激活成骨细胞与破骨细胞相关基因的表达。目前有研究证实Notch信号通路在MSCs的多向分化中发挥着重要作用，主要表现为抑制成骨分化[20]。多种因素可抑制该信号通路表达而促进成骨分化，如ICA、磷酸钙及锶等[21-23]。Xu等[23]通过RNA测序显示ICA治疗后Notch通路中多个基因表达降低，光电导继电器进一步检测显示Notch配体Jagg-1、lunatic fringe基因和Notch信号下游靶基因Hey-1的mRNA水平也显著下降，这提示ICA可通过抑制Notch信号通路的表达从而促进成骨分化，有效提高骨量。邓宇等[24]研究表明ICA通过激活 Notch 信号通路促进骨BMSCs向成骨细胞分化，实验中还发现ICA提高了BMSCs细胞成骨分化相关因子中Hesl、Runx2、mRNA的表达，但Notch1、Jagged1、CBF1蛋白表达水平也同样上升了。上述两项研究提示Notch信号通路在成骨分化的作用上仍存在争议，需要后期更深入的研究，但ICA可作用于该信号通路刺激成骨分化是普遍认可的(见图4)。

图4 ICA通过抑制Notch信号促进成骨分化机制Fig.4 Mechanism of icariin promoting osteogenic differentiation by inhibiting Notch signal

5 ICA通过MAPK通路诱导BMSCs的成骨分化

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)是一种由多种信使组成的家族，主要有ERK、p38激酶和JNK 3种。ERK介导的信号通路一直是BMSCs成骨分化过程中研究的热点。既往研究[25]表明BMSCs成骨或成脂分化可通过ERK的激活或抑制进行控制，而且PDGF、FGF和IGF-I等多种骨活性剂均可通过ERK信号途径诱导成骨分化[26]。p38信号通路是成骨分化过程中的介体，调控p38也可促进BMSCs在体外成骨分化。研究已证实p38信号通路在体外有助于促进成骨细胞功能表达和体内骨矿化[27]，而 JNK信号通路在人骨膜细胞成骨细胞分化中发挥着重要作用[28]。MAPK信号通路在细胞膜外可被多种因素刺激激活，包括激素、化学与物理刺激、神经递质、细胞因子等，激活后可从细胞表面传递到细胞核，调控基因表达从而控制细胞增殖、分化和凋亡。目前有研究认为ICA可作为细胞外因素刺激MAPK信号通路诱导BMCs进行成骨分化[29]。Wu等[30]研究发现20 μmol/L的ICA虽然不能刺激BMCs的增殖，但是可刺激它向成骨分化，并认为这是ICA可刺激成骨相关细胞因子导致的结果。为进一步研究MAPK级联在ICA诱导成骨分化中的作用，他们对ICA刺激下ERK、p38和JNK的蛋白水平进行检测，并运用相关抑制剂做对比实验发现，ERK、p38和JNK表达水平与对照组比在培养15～120 min后都有所上升，这证实了MAPK参与ICA诱导BMSCs成骨分化的过程，但笔者认为在今后仍需做更多实验去佐证。具体机制见图5。

图5 ICA通过MAPK通路诱导BMSCs的成骨分化机制Fig.5 Mechanism of icariin inducing BMSCs osteogenic differentiation through MAPK pathway

6 总结与展望

目前淫羊藿在治疗股骨头坏死、骨质疏松症以及骨性关节炎等方面具有良好的临床疗效，已被广大临床工作者逐渐接受。ICA作为淫羊藿的主要药效成分，对于上述疾病的有效治疗作用已通过实验研究得到充分证实。通过对ICA治疗ONFH的分子机制进行综述后，笔者认为ICA主要可通过以下几种途径促进ONFH修复：①通过经典Wnt/β-catenin促进成骨细胞增殖分化；②介导RANK/RANKL信号通路抑制破骨细胞分化；③刺激DEC1与PI3K/AKT信号通路调节骨代谢；④抑制Notch信号促进成骨分化；⑤刺激MAPK通路诱导BMSCs的成骨分化。这些都有助于成骨细胞在股骨头坏死早期的增殖分化，抑制破骨细胞分化从而增加股骨头骨量以及骨强度。另有研究发现 HIF-1α信号通路可作为PI3K/AKT信号通路下游基因靶点，促进血管内皮细胞的增殖，增加一氧化氮的分泌从而提高血管通透性，可有效改善股骨头周围血运状态[31-32]。目前仍缺乏针对HIF-1α、TGF-β、FoxO 等自身信号通路的动物实验研究，笔者认为这些尚未发现的信号通路作用方式可能存在于上述相关通路的下游，需要进一步通过实验验证。