异紫杉脂素治疗对去卵巢大鼠骨量流失和骨密度降低保护作用的机制研究

陈建军 焦宏伟 张敬

1.海南省干部疗养院(海南省老年病医院)中西医结合内科，海南 海口 571100 2.海南省干部疗养院(海南省老年病医院)内分泌科，海南 海口 571100 3.海南医学院第一附属医院康复医学科，海南 海口 570311

随着我国人口老龄化的增加，骨质疏松症(osteoporosis，OP)已成为最常见的慢性病之一[1]。OP是一种以骨量减少、骨密度降低、骨结构退化为特征的代谢性骨科疾病。OP多见于老年和绝经后妇女，女性发病率高于男性[2]。OP患者体内骨代谢平衡被打破，骨吸收远大于骨形成；引起骨痛、脊柱后凸、身高缩小、呼吸功能下降和骨折等严重损害全身的症状[3]。目前，钙、体育锻炼和骨吸收抑制剂被广泛用于OP的治疗，但这些药物只能缓解患者的症状，不能预防疾病的发生[4]。红豆杉分布在我国云南省，以其抗癌化学成分紫杉醇而闻名。在当地，这种树由于寿命长并且对老年人的慢性疾病如肾功能不全和糖尿病具有改善作用，因此被称为不老树。异紫杉脂素(Isotaxiresinol，IXO)是从红豆杉提取一种芳基四氢萘型木脂素[5]，具有良好的抗炎、抗癌及调节免疫的功效，且具有类雌激素的作用[6]。因此，本研究假设异紫杉脂素对绝经后骨质疏松症有保护作用，使用去卵巢切除(OVX)大鼠模型评估IXO的抗骨质疏松活性并探索可能的机制。

1 材料和方法

1.1 模型建立和药物治疗

从上海实验动物中心获得雌性SD雌鼠(3月龄，230～260 g)，并在可控温度和湿度的房间中保持12 h的明暗循环。在实验期间，允许实验大鼠自由进食实验室颗粒饲料和水。适应饲养7 d后，使用水合氯醛(40 mg/kg)腹膜内麻醉大鼠，并暴露其两个卵巢，立即结扎卵巢并切除；假手术组仅通过暴露卵巢进行假手术。随后大鼠随机分为3组：假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)及异紫杉脂素组(IXO)；IXO组大鼠在去卵巢大鼠手术1周后每天给予剂量为100 mg/kg异紫杉脂素(上海莼试生物技术有限公司购买，批号：322123，纯度>98%)进行灌胃治疗，为期12周，其余几组同时给予生理盐水灌胃治疗。治疗12周后，通过腹膜内注射水合氯醛麻醉所有动物，从主动脉静脉收集血液，并将血清保持在-70℃以下。然后，处死大鼠收集双侧股骨进行下一步检测。

1.2 Micro-CT检测

使用CANCOuCT80(Micro Computed Tomography，Micro-CT)对左股骨远端进行微计算机断层扫描。体素大小为0.08 mm，切片厚度为0.5 mm，皮质阈值为464 mg/cm3。使用测量模式将整个骨骼分为皮层或松质骨作为剥离模式。此模式可以自动检测内部阈值。获得侦察扫描并确定生长板后，在生长线以下的左股骨远端1～5 mm区域扫描100个横截面切片的横向图像集。骨微结构参数包括骨密度(BMD)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨体积/总体积(BV/TV)、骨小梁分离度(TBSp)，通过使用内置软件进行定量分析来确定微观参数。

1.3 骨代谢指标检测

通过使用免疫测定试剂盒(GuYan Biotech Co.,Ltd. Shanghai，China)测量血清Ⅰ型前胶原N端前肽(P1NP)水平来评估骨形成。通过使用免疫测定试剂盒(Fubo Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China)测量Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)的血清浓度来评估骨吸收。

1.4 HE组织切片分析

Micro-CT检测完毕后，使用10%EDTA脱钙4～6周，每周换液一次；脱钙完毕后在10%福尔马林中固定过夜，然后包埋在石蜡中。用苏木精和曙红(H&E)对包埋标本的连续切片进行染色，光学显微镜观察并选取合适部位进行观察。

1.5 蛋白质印迹检测

将裂解缓冲液添加到裂解的骨组织中行冰浴1 h。然后，将组织放入离心机中以14 000 g离心10 min，并使用BCA方法对蛋白质进行定量。接下来通过微读数器获得蛋白质的吸光度和标准曲线，将其用于计算组织中的蛋白质浓度。随后，对组织样本中的蛋白质进行变性和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。当标记蛋白以直线到达玻璃板的底部时，观察到标记蛋白的位置并停止电泳。然后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA，美国)上，并与封闭缓冲液反应1.5 h。之后，依次添加抗PI3K一抗(1∶1000)，抗Akt一抗(1∶1000)，抗RUNX-2一抗和二抗(1∶1000)；β-actin作为内参蛋白。漂洗后在黑暗中用化学发光试剂对蛋白质进行足够的显色，持续1 min。

1.6 统计学分析

数据使用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据使用均数±标准差表示。使用单向方差分析及事后检验对多组之间差异进行比较。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 Micro-CT检测结果分析

股骨的干骺端骨小梁三维重建如图1A所示，股骨的微观参数如图1B～F所示。OVX组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Sham组明显降低(P<0.05)，而Tb.Sp较Sham组明显升高。IXO组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于OVX组(P<0.05)，而Tb.Sp较OVX组明显降低(P<0.05)。

图1 各组大鼠股骨干骺端骨小梁形态学检测结果Fig.1 Morphological test results of the femoral metaphyseal trabeculae in each group of rats注：和Sham组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

2.2 组织切片结果分析

各组大鼠治疗12周时股骨干骺端进行H&E染色结果，如图2所示。在OVX组中，组织学检查显示出大量的骨小梁已经消失和少量不规则排列的骨小梁。而使用IXO治疗后的骨小梁相比；骨小梁的数量和之间的连接在一定程度上得到了改善。

图2 三组大鼠股骨的组织病理学 A：Sham，B：OVX，C：IXO，苏木精-伊红染色(放大倍数，×10)。Fig.2 Histopathology of femurs in the three groups. A：Sham，B：OVX，C：IXO，Hematoxylin eosin staining (Magnification，×10)

2.3 骨代谢指标分析

三组大鼠治疗12周后血清骨代谢指标水平如图3中。与Sham组大鼠相比，OVX组大鼠血清中P1NP和β-CTX水平显著升高(P<0.05)。然而，使用IXO治疗显著降低P1NP和β-CTX显著降低(P<0.05)。

图3 各组大鼠血清骨代谢指标的水平Fig.3 Serum bone metabolism index levels in each group of rats注：Sham组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

2.4 治疗对PI3K、Akt和RUNX-2表达的影响

IOX治疗对PI3K、Akt和RUNX-2表达的影响如图4所示。图4显示了OVX组大鼠的PI3K、Akt和RUNX-2水平较Sham组显著降低(P<0.05)。与OVX组相比，IOX治疗后的股骨组织中PI3K、Akt和RUNX-2水平表达上调(P<0.05)。

图4 使用WB检测PI3K、Akt和RUNX-2相对表达Fig.4 Relative expression of PI3K, Akt, and RUNX-2 using Western blotting注：Sham组比较，*P<0.05；和OVX组比较，#P<0.05。

3 讨论

骨质疏松症是严重威胁老年人健康和生活质量的疾病，随着社会人口老龄化的发展，其发病率逐年上升。特别是绝经后的老年妇女中骨质疏松症的发生率极高，并且由此引起的并发症，例如疼痛和骨质疏松性骨折，严重影响患者的身心健康以及生活质量。此外，全社会已在预防和治疗该疾病方面投入了大量的人力、物力和财力[7]。因此，预防骨质疏松相关并发症对临床治疗骨质疏松症具有重要意义。

目前的研究认为骨质疏松症的发生与破骨细胞和成骨细胞在体内的功能紊乱和比例失调引起的骨代谢紊乱密切相关。有研究报导[8-9]显示，绝经后妇女的雌激素含量急剧下降，这导致破骨细胞功能亢进和体内成骨细胞抑制，从而使破骨细胞诱导的骨破坏明显超过成骨细胞诱导的骨形成并导致去骨质疏松症。同时，骨髓间充质干细胞是体内成骨细胞和破骨细胞分化的主要来源，而在刺激雌激素减少的情况下，分化为成骨细胞的大量骨髓间充质干细胞的比例降低，从而进一步影响了骨骼形成并导致骨质减少。在本研究中，采用雌性大鼠去卵巢，从而引起雌激素的突然减少。12周后，检测大鼠股骨骨密度，去卵巢大鼠骨密度显著下降，说明本研究去卵巢诱导骨质疏松大鼠模型制备成功。异紫杉脂素被肠细菌转化为激素样哺乳动物衍生物肠二醇，然后被结肠菌群氧化为肠内酯。肠二醇和肠内酯通过与雌激素受体(ER)结合而发挥其雌激素作用，或通过与内雌激素竞争ER表现出抗雌激素作用[10]。因此，异紫杉脂素在雌激素依赖性疾病如乳腺癌、结肠癌、肝癌和前列腺癌以及更年期症状的治疗中表现出作用[10]。异紫杉脂素可认为是一种具有雌激素活性的植物雌激素。本研究使用异紫杉脂素治疗12周发现去卵巢大鼠骨密度、骨量较OVX组显著改善，再次证实了异紫杉脂素有抗绝经后骨质疏松症的效果。

骨转换包括两个连续的过程：旧骨的去除和新骨的形成。在本研究中，使用Micro-CT发现OVX组大鼠股骨的骨密度显著下降，用异紫杉脂素治疗后，BMD、BV/TV，Tb.N和Tb.Th与OVX组相比显著改善，表明骨小梁的微观结构得到改善。血清β-CTX是骨骼中I型胶原的降解产物。检测血清β-CTX含量可以特异性地反映破骨细胞的吸收活性。成骨细胞可以分泌骨特异性P1NP，P1NP可以反映骨形成的状态。血清学指标显示OVX组的β-CTX和P1NP较Sham组明显升高，而异紫杉脂素治疗后大鼠的骨转换速度较OVX组明显下降。本研究表明异紫杉脂素可降低骨代谢速度来促进OVX大鼠的骨形成来保护骨组织。

PI3K/Akt信号传导途径是至关重要的细胞信号转导途径，已被证实在诸如细胞增殖，分化，凋亡和坏死等生理和病理过程中起着重要的调节作用。研究[11]报道，PI3K/Akt细胞信号传导途径可以激活β-catenin及其磷酸化，而且它可以促进下游信号通路中靶基因的转录和蛋白质的翻译。同时，由PI3K/Akt信号通路中的Akt磷酸化产生的p-Akt能够促进β-catenin的磷酸化并触发细胞增殖[12]。简而言之，细胞中的PI3K和P85可以通过各种刺激来激活，从而募集并激活细胞周围的P110，从而对细胞膜表面的磷脂酰肌醇二磷酸起作用并激活，从而形成大量的磷脂酰肌醇三磷酸[13]。作为第二信使，磷脂酰肌醇三磷酸可以进一步激活Akt的磷酸化以生成p-Akt，从而在信号转导中发挥作用，通过下游GSK3β和Wnt途径发挥协同作用，并调节细胞分化的发生[14]。本研究结果表明，在去卵巢大鼠的PI3K/Akt信号通路较Sham组的大鼠明显被抑制，PI3K、Akt及RUNX-2蛋白的表达水平显著降低，而在经过IXO治疗后，PI3K/Akt信号通路较OVX组明显激活，PI3K、Akt及RUNX-2相关蛋白表达明显上调。因此笔者认为IXO能保护去卵巢对大鼠骨量破坏作用可能是介导PI3K/Akt信号通路来实现的。

总的来说，异紫杉脂素可能通过降低骨转换速度及激活PI3K/Akt信号通路来改善骨密度、骨微观结构和骨强度以及治疗绝经后骨质疏松症。